Begeleide machine learning voor semi-kwantificering van extracellulair DNA in Glomerulonephritis
Summary
Extracellulair DNA (ecDNA) dat vrijkomt bij de celdood is pro-inflammatorium en draagt bij aan ontsteking. Meting van ecDNA op de plaats van letsel kan de werkzaamheid van therapeutische behandeling in het doelorgaan bepalen. Dit protocol beschrijft het gebruik van een machine learning tool om de meting van ecDNA in nierweefsel te automatiseren.
Abstract
Glomerulaire celdood is een pathologisch kenmerk van myeloperoxidase anti neutrofiele cytoplasmatische antilichaam geassocieerd vasculitis (MPO-AAV). Extracellulair deoxyribonucleïnezuur (ecDNA) komt vrij tijdens verschillende vormen van celdood, waaronder apoptose, necrose, necroptose, neutrofiele extracellulaire vallen (NETs’ s) en pyroptose. Meting van deze celdood is tijdrovend met verschillende biomarkers die nodig zijn om de verschillende biochemische vormen van celdood te identificeren. Meting van ecDNA wordt over het algemeen uitgevoerd in serum en urine als surrogaat voor nierschade, niet in het eigenlijke doelorgaan waar de pathologische schade optreedt. De huidige moeilijkheid bij het onderzoeken van ecDNA in de nier is het gebrek aan methoden voor formaline vast paraffine embedded weefsel (FFPE) zowel experimenteel als in gearchiveerde menselijke nierbiopten. Dit protocol biedt een samenvatting van de stappen die nodig zijn om te vlekken voor ecDNA in FFPE weefsel (zowel menselijke als murine), blus autofluorescentie en meet de ecDNA in de resulterende beelden met behulp van een machine learning tool van de openbaar beschikbare open source ImageJ plugin trainable Weka segmentatie. Trainable Weka segmentatie wordt toegepast op ecDNA binnen de glomeruli waar het programma leert om ecDNA te classificeren. Deze classificatie wordt toegepast op latere verworven nierbeelden, waardoor de noodzaak van handmatige annotaties van elke afzonderlijke afbeelding wordt verminderd. Het aanpassingsvermogen van de trainbare Weka-segmentatie wordt verder aangetoond in nierweefsel van experimentele murineanti-MPO glomerulonephritis (GN), om NET’s en ecMPO, gemeenschappelijke pathologische bijdragen aan anti-MPO GN te identificeren. Deze methode biedt objectieve analyse van ecDNA in nierweefsel dat duidelijk de werkzaamheid aantoont waarin het trainbare Weka-segmentatieprogramma ecDNA kan onderscheiden tussen gezond normaal nierweefsel en ziek nierweefsel. Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast om ecDNA, NETs en ecMPO in andere organen te identificeren.
Introduction
Myeloperoxidase anti neutrofiele cytoplasmatische antilichaam geassocieerd vasculitis (MPO-AAV) is een auto-immuunziekte die resulteert in nierfalen van pathologische glomerulaire letsel met aanzienlijke celdood en het vrijkomen van deoxyribonucleic zuur (DNA)1,2. DNA kan het immuunsysteem activeren door op te treden als een gevaarssignaal. Onder normale gezonde omstandigheden biedt de nucleaire locatie van DNA bescherming tegen blootstelling aan het immuunsysteem. Zelf-DNA dat extracellulair vrijkomt tijdens pathogene processen of auto-immuniteit wordt door het immuunsysteem gezien als een krachtige proinflammatoire schade geassocieerd moleculaire zelf-eiwit (DAMP)3. Extra cellulair DNA (ecDNA) wordt vrijgegeven uit stervende cellen door middel van verschillende mechanismen die worden beheerst door verschillende biochemische trajecten, zoals apoptose, necroptosis neutrofiele extracellulaire valvorming (NETs), necrose of pyroptose4,5,6,7,8.
We beschrijven hierin methoden om ecDNA vrij te geven uit stervende cellen in secties van formaline vaste paraffine embedded (FFPE) nieren van experimentele anti-MPO GN en nierbiopten van patiënten met MPO-AAV9,10. Er bestaan meerdere methoden voor de detectie van circulerend dubbelstrengs DNA (dsDNA) en DNA-complexen uit zowel serum als urine en van in vitro tests11,12. Deze methoden, hoewel nauwkeurig bij het bepalen van de hoeveelheid ecDNA, bepalen niet waar de ecDNA anatomisch wordt vrijgegeven. Er zijn methoden die specifieke meting van ecDNA beschrijven, zoals tunel voor apoptose en meting van celpuin13,14. Er is geen methode die beschrijft het meten ecDNA culmineerde uit alle vormen van celdood in FFPE nieren waar de pathologische schade optreedt. Dit is belangrijk om te bepalen of experimentele therapeutische behandelingen de ecDNA wissen van de sites van pathologische schade in het eigenlijke doelorgaan.
De verwerving van meerdere afbeeldingen van niermonsters creëert een hoog volume aan gegevens die vaak door één enkele gebruiker worden geanalyseerd. Dit is arbeidsintensief, tijdrovend en kan worden onderworpen aan onbetrouwbare reproduceerbaarheid door andere gebruikers, als gevolg van vooringenomenheid van de gebruiker. Trainable Weka-segmentatie is een open-source softwareplug-in voor imagej die geavanceerde bioinformatische tools gebruikt om pixels te classificeren met behulp van machine learning-algoritmen15,16. Deze methode is “trainable” waarbij het leert van de classificatie van segmenten pixels van de gebruiker en de nieuwe geleerde classificatie toepast op andere afbeeldingen. Deze methode is gebaseerd op algemene analysetools binnen het ImageJ-programma die worden gebruikt om elke pixel in een segment te “classificeren” als behorend tot een specifieke “klasse”. Zodra het programma leert de “classificaties”, kunnen ze worden gebruikt om andere soortgelijke geclassificeerde segmenten te identificeren binnen dezelfde afbeelding. Dit model wordt vervolgens opgeslagen en toegepast op andere sets afbeeldingen binnen hetzelfde experiment.
Huidige obstakels voor het bepalen van ecDNA in situ in niersecties is de endogene autofluorescentie van fixatie in formaline en de arbeidsintensieve analyse van de beelden. We beschrijven hier hoe je deze autofluorescentie doven, ecDNA detecteren en gecontroleerde machine learning gebruiken voor een hoge doorvoermeting van ecDNA. We hebben eerder de meting van NETs en extracellulaire MPO (ecMPO) gepubliceerd met behulp van een macro in ImageJ, we demonstreren nu semi-automatisering van deze methoden met behulp van supervised machine learning1. We tonen het aanpassingsvermogen van de machine learning tool, om een alternatieve vlek voor NETs en ecMPO te classificeren binnen hetzelfde beeld. Deze kleuringsmethoden die hier worden beschreven voor het opsporen van ecDNA, NETs en ecMPO kunnen worden vertaald naar andere vaste organen en ziekten waar ecDNA, NETS en ecMPO een rol spelen bij het bestendigen van ziekten zoals reumatoïde artritis en lupus17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er bestaan meerdere protocollen die pro-inflammatoriummarkeringen meten in het serum en de urine van zowel patiënten als muismodellen van glomerulonephritis. Dit beschreven protocol maakt analyse van de producten van celdood (ecDNA, NETs en ecMPO) direct binnen de glomerulus mogelijk. De meest cruciale stappen in dit protocol is de weefselvoorbereiding en beeldvorming. Het belangrijkste beperkende element van het gebruik van een fluorescerende kleuring methode voor analyse is het weefsel autofluorescentie. Formaline vas…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij erkennen Monash Micro Imaging voor het gebruik van Nikon C1 rechtopstaande confocale laserscanmicroscoop en het Monash Histology Platform voor de verwerking van nierweefsel.
Materials
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A2153 | 5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed. |
| Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-21468 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-121468 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-21441 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken sera | SIGMA | C5405 | Made up in 1%BSA/PBS |
| Coverslips 24 x60 mm | Azerscientific | ES0107222 | #1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy |
| EDTA 10mM | SIGMA | E6758 | Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution |
| Ethanol 30%, 70% and 100% | Chem Supply | UN1170 | Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water |
| Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin) | TRAJAN | NBF-500 | Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood |
| Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25×75 x1.0mm | TRAJAN | J3800AM4 | Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step |
| Goat anti human/mouse MPO antibody | R&D | AF3667 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Histosol | Clini Pure | CPL HISTOSOL 08 | Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood |
| Hydrophobic pen | VECTOR Labs | H-400 | Use to draw circle around kidney tissue |
| Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4) | ABCAM | ab128086 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope | Coherent Scientific | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA | P38135 | 0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time |
| Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless | Tefal | GSA-P2530738 | Purchased at local homeware store |
| Prolong Gold DAPI | Life Technologies | P36962 | Apply drops directly to coverslip |
| Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody | ABCAM | ab8227 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody | ABCAM | ab5103 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Staining rack 24 slides | ProScitech | H4465 | Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven |
| Sudan Black B | SIGMA | 199664 | 0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature |
| Tris 10mM | SIGMA | T4661 | Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution |
| Xylene | Trajan | XL005/20 | Must be use used in a fume hood |
References
- O’Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
- Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis. Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).
- Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. Programmed cell death as a defence against infection. Nat Rev Immunol. 17 (3), 151-164 (2017).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Wyllie, A. H., Kerr, J. F., Currie, A. R. Cell death: the significance of apoptosis. International Review of Cytology. 68, 251-306 (1980).
- Fiers, W., Beyaert, R., Declercq, W., Vandenabeele, P. More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage. Oncogene. 18 (54), 7719-7730 (1999).
- Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
- Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cellular Microbiology. 8 (11), 1812-1825 (2006).
- Ooi, J. D., Gan, P. Y., Odobasic, D., Holdsworth, S. R., Kitching, A. R. T cell mediated autoimmune glomerular disease in mice. Current Protocols in Immunology. 107, 15.27.11-15.27.19 (2014).
- Ruth, A. J., et al. Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).
- Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).
- Burnham, P., et al. Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract. Nature Communications. 9 (1), 2412 (2018).
- Gobe, G. Identification of apoptosis in kidney tissue sections. Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).
- Olander, M., Handin, N., Artursson, P. Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis. Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).
- Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases. Nature Reviews Rheumatology. 14 (8), 467-475 (2018).
- Chapman, E. A., et al. Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus. Frontiers in Immunology. 10, 423 (2019).
- Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histology & Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).
- Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).
- Schreiber, A., et al. Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).
- Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis. Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).
