ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस में एक्स्ट्रासेलुलर डीएनए के अर्ध-क्वांटिफिकेशन के लिए पर्यवेक्षित मशीन लर्निंग
Summary
सेल डेथ के दौरान जारी एक्स्ट्रासेलुलर डीएनए (ecDNA) प्रोमिनेमेटरी है और सूजन में योगदान देता है। चोट की साइट पर ecDNA की माप लक्ष्य अंग में चिकित्सीय उपचार की प्रभावकारिता निर्धारित कर सकते हैं। यह प्रोटोकॉल गुर्दे के ऊतकों में ecDNA के माप को स्वचालित करने के लिए एक मशीन लर्निंग टूल के उपयोग का वर्णन करता है।
Abstract
ग्लोमेरुलर सेल डेथ माइलोलॉक्सिडेज एंटी न्यूट्रोफिल साइटोप्लाज्मिक एंटीबॉडी एसोसिएटेड वैक्यूलाइटिस (एमपीओ-एएवी) की एक पैथोलॉजिकल विशेषता है। एक्सपेरिमेंटल डिऑक्सीरिबोक्यूक्लिक एसिड (एक्डना) सेल डेथ के विभिन्न रूपों के दौरान जारी किया जाता है जिसमें एपोप्टोसिस, नेक्रोसिस, नेक्रोटोसिस, न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलुलर ट्रैप (नेट्स) और पायरोप्टोसिस शामिल हैं। इस सेल मृत्यु का मापन सेल मृत्यु के विभिन्न जैव रासायनिक रूपों की पहचान करने के लिए आवश्यक कई अलग-अलग बायोमार्कर के साथ समय लगता है। EcDNA का माप आम तौर पर गुर्दे की क्षति के लिए एक किराए के रूप में सीरम और मूत्र में आयोजित किया जाता है, वास्तविक लक्ष्य अंग में नहीं जहां रोग चोट होती है । गुर्दे में ecDNA की जांच में वर्तमान कठिनाई दोनों प्रयोगात्मक और संग्रहीत मानव गुर्दे बायोप्सी में फॉर्मेलिन फिक्स्ड पैराफिन एम्बेडेड ऊतक (एफएफपीई) के लिए तरीकों की कमी है। यह प्रोटोकॉल एफएफपीई ऊतक (मानव और मुरीन दोनों) में ecDNA के लिए दाग करने के लिए आवश्यक चरणों का सारांश प्रदान करता है, ऑटोफ्लोरेसेंस को बुझाता है और सार्वजनिक रूप से उपलब्ध ओपन सोर्स इमेजजे प्लगइन ट्रेनेबल वेका सेगमेंटेशन से मशीन लर्निंग टूल का उपयोग करके परिणामस्वरूप छवियों में ecDNA को मापता है। ट्रेनेबल वेका सेगमेंटेशन को ग्लोमेरुली के भीतर ecDNA पर लागू किया जाता है जहां कार्यक्रम ecDNA को वर्गीकृत करना सीखता है। यह क्लासिफायर बाद में अधिग्रहीत गुर्दे की छवियों पर लागू होता है, जिससे प्रत्येक व्यक्ति की छवि के मैनुअल एनोटेशन की आवश्यकता कम हो जाती है। प्रशिक्षित वेका विभाजन की अनुकूलनशीलता को प्रायोगिक मुरीन एंटी-एमपीओ ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस (जीएन) से गुर्दे के ऊतकों में आगे प्रदर्शित किया जाता है, ताकि एनईटीएस और ईसीएमओ की पहचान की जा सके, जो एमपीओ जीएन के लिए सामान्य रोग योगदानकर्ता हैं। यह विधि गुर्दे के ऊतकों में ecDNA का उद्देश्य विश्लेषण प्रदान करती है जो स्पष्ट रूप से प्रभावकारिता को दर्शाती है जिसमें प्रशिक्षित वेका विभाजन कार्यक्रम स्वस्थ सामान्य गुर्दे के ऊतकों और रोगग्रस्त गुर्दे के ऊतकों के बीच ecDNA को अलग कर सकता है। इस प्रोटोकॉल को अन्य अंगों में ECDNA, NETs और ecMPO की पहचान करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।
Introduction
माइलोप्रोक्सिडेज एंटी न्यूट्रोफिल साइटोप्लाज्मिक एंटीबॉडी से जुड़े वैक्यूलाइटिस (एमपीओ-एएवी) एक ऑटोइम्यून रोग है जिसके परिणामस्वरूप पैथोलॉजिकल ग्लोमेरुलर चोट से गुर्दे की विफलता होती है जिसमें काफी सेल मृत्यु होती है और डिऑक्सीरिबोक्यूक्लिक एसिड (डीएनए)1,,2की रिहाई होती है। डीएनए खतरे के संकेत के रूप में कार्य करके प्रतिरक्षा प्रणाली को सक्रिय कर सकता है। सामान्य स्वस्थ परिस्थितियों में, डीएनए का परमाणु स्थान प्रतिरक्षा प्रणाली के संपर्क से सुरक्षा प्रदान करता है। आत्म-डीएनए जो रोगजनक प्रक्रियाओं या ऑटोनियुमाइंसिटी के दौरान अतिरिक्त रूप से जारी किया जाता है, प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा आणविक आत्म-प्रोटीन (नम) 3 से जुड़े एक शक्तिशाली प्रोइनफ्लेमेटरी क्षति के रूप मेंदेखा जाताहै। अतिरिक्त सेलुलर डीएनए (ecDNA) को कई अलग-अलग तंत्रों के माध्यम से मरने वाली कोशिकाओं से छोड़ा जाता है जो अलग-अलग जैव रासायनिक मार्गों द्वारा शासित होते हैं, जैसे एपोप्टोसिस, नेक्रोप्टोसिस न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलर ट्रैप फॉर्मेशन (नेट्स), नेक्रोसिस या पायरोप्टोसिस4,,5,,6,,7,,8।
हम एमपीओ-एएवी9,,10के रोगियों से प्रायोगिक एंटी-एमपीओ जीएन और किडनी बायोप्सी से फॉर्मलिन फिक्स्ड पैराफिन एम्बेडेड (एफएफएपी) गुर्दे के वर्गों में मरने वाली कोशिकाओं से जारी ecDNA को दाग और मापने के लिए इसके तरीकों का वर्णन करते हैं। सीरम और मूत्र दोनों से और इन विट्रो में से11,12से डबल फंसे डीएनए (डीएसडीएनए) और डीएनए परिसरों का पता लगाने के लिए कई तरीके मौजूद हैं । ये तरीके, हालांकि ecDNA की मात्रा का निर्धारण करने में सटीक, यह निर्धारित नहीं करते हैं कि ईसीडीएनए शारीरिक रूप से कहां जारी किया जाता है। ऐसे तरीके हैं जो ईसीडीएनए के विशिष्ट माप जैसे एपोप्टोसिस के लिए ट्यूनल और सेल मलबे की माप13,14का वर्णनकरतेहैं । ऐसा कोई तरीका नहीं है जो एफएफएपी गुर्दे में सेल मृत्यु के सभी रूपों से होने वाली ईसीडीएनए को मापने का वर्णन करता है जहां रोग क्षति होती है। यह निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि क्या प्रयोगात्मक चिकित्सीय उपचार वास्तविक लक्ष्य अंग में रोग चोट की साइटों से ecDNA समाशोधन कर रहे हैं ।
गुर्दे के नमूनों से कई छवियों का अधिग्रहण डेटा की एक उच्च मात्रा बनाता है जिसका विश्लेषण आमतौर पर एक ही उपयोगकर्ता द्वारा किया जाता है। यह श्रम गहन, समय लेने वाला है और उपयोगकर्ता पूर्वाग्रह के कारण अन्य उपयोगकर्ताओं द्वारा अविश्वसनीय प्रजनन क्षमता के अधीन हो सकता है। ट्रेनेबल वेका सेगमेंटेशन इमेजजे के लिए एक ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर प्लगइन है जो मशीन लर्निंग एल्गोरिदम15,,16का उपयोग करके पिक्सल को वर्गीकृत करने के लिए अत्याधुनिक बायोइन्फॉर्मेटिक टूल का उपयोग करता है। यह विधि “ट्रेनेबल” है जिससे यह पिक्सल के सेगमेंट के उपयोगकर्ता के वर्गीकरण से सीखता है और नए सीखे गए वर्गीकरण को अन्य छवियों पर लागू करता है। यह विधि ImageJ कार्यक्रम के भीतर सामान्य विश्लेषण उपकरणों पर निर्भर करती है जिसका उपयोग प्रत्येक पिक्सेल को एक विशिष्ट “वर्ग” से संबंधित सेगमेंट में “वर्गीकृत” करने के लिए किया जाता है। एक बार जब कार्यक्रम “क्लासिफायर” सीखता है, तो उनका उपयोग एक ही छवि के भीतर अन्य समान वर्गीकृत खंडों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। इस मॉडल को तब सहेजा जाता है और उसी प्रयोग के भीतर छवियों के अन्य सेटों पर लागू किया जाता है।
गुर्दे के वर्गों में सीटू में ecDNA का निर्धारण करने के लिए वर्तमान बाधाएं फॉर्मेलिन में निर्धारण और छवियों के श्रम-गहन विश्लेषण से अंतर्जात ऑटोफ्लोरेसेंस है। हम यहां वर्णन करते हैं कि इस ऑटोफ्लोरेसेंस को कैसे बुझाया जाए, ecDNA का पता लगाया जाए, और ecDNA के उच्च थ्रूपुट माप के लिए पर्यवेक्षित मशीन लर्निंग का उपयोग करें। हमने पहले इमेजजे में मैक्रो का उपयोग करके एनईटी और एक्सट्रासेलुलर एमपीओ (ईसीएमपीओ) की माप प्रकाशित की है, अब हम पर्यवेक्षित मशीन लर्निंग1का उपयोग करके इन तरीकों के अर्ध स्वचालन का प्रदर्शन करते हैं। हम एक ही छवि के भीतर NETs और ecMPO के लिए एक वैकल्पिक दाग वर्गीकृत करने के लिए मशीन लर्निंग उपकरण की अनुकूलनशीलता प्रदर्शित करते हैं। ईसीडीएनए, एनईटी और ईसीएमपीओ का पता लगाने के लिए यहां वर्णित इन धुंधला तरीकों का अनुवाद अन्य ठोस अंगों और रोगों में किया जा सकता है जहां ईसीडीएनए, नेट और ईसीएमपीओ रोग को बनाए रखने में भूमिका निभाते हैं जैसे रूमेटॉयड आर्थराइटिस और ल्यूपस17,,18।
Protocol
Representative Results
Discussion
कई प्रोटोकॉल मौजूद हैं जो सीरम और रोगियों और ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस के माउस मॉडल दोनों के मूत्र में प्रोमिन्फ्लैमेटरी मार्कर को मापते हैं। यह वर्णित प्रोटोकॉल सीधे ग्लोमेरुलस के भीतर सेल डेथ (ईसीडीए?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम निकॉन सी 1 ईमानदार कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप और किडनी ऊतक के प्रसंस्करण के लिए मोनाश हिस्टोलॉजी प्लेटफॉर्म के उपयोग के लिए मोनाश माइक्रो इमेजिंग स्वीकार करते हैं।
Materials
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A2153 | 5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed. |
| Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-21468 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-121468 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-21441 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken sera | SIGMA | C5405 | Made up in 1%BSA/PBS |
| Coverslips 24 x60 mm | Azerscientific | ES0107222 | #1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy |
| EDTA 10mM | SIGMA | E6758 | Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution |
| Ethanol 30%, 70% and 100% | Chem Supply | UN1170 | Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water |
| Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin) | TRAJAN | NBF-500 | Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood |
| Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25×75 x1.0mm | TRAJAN | J3800AM4 | Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step |
| Goat anti human/mouse MPO antibody | R&D | AF3667 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Histosol | Clini Pure | CPL HISTOSOL 08 | Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood |
| Hydrophobic pen | VECTOR Labs | H-400 | Use to draw circle around kidney tissue |
| Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4) | ABCAM | ab128086 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope | Coherent Scientific | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA | P38135 | 0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time |
| Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless | Tefal | GSA-P2530738 | Purchased at local homeware store |
| Prolong Gold DAPI | Life Technologies | P36962 | Apply drops directly to coverslip |
| Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody | ABCAM | ab8227 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody | ABCAM | ab5103 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Staining rack 24 slides | ProScitech | H4465 | Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven |
| Sudan Black B | SIGMA | 199664 | 0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature |
| Tris 10mM | SIGMA | T4661 | Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution |
| Xylene | Trajan | XL005/20 | Must be use used in a fume hood |
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