글로메룰로네프염의 세포외 DNA의 반정화를 위한 감독된 기계 학습
Summary
세포 사멸 중에 방출되는 세포외 DNA(ecDNA)는 염증성 염증에 기여합니다. 상해 부위에서 ecDNA의 측정은 표적 기관에서 치료 치료의 효능을 결정할 수 있다. 이 프로토콜은 신장 조직에서 ecDNA의 측정을 자동화하기 위해 기계 학습 도구의 사용을 설명합니다.
Abstract
구체 세포 사멸은 골수퍼록시다제 항 호중구 세포질 항체 관련 혈관염(MPO-AAV)의 병리학적 특징이다. 세포외 탈옥리보핵산(ecDNA)은 세포사멸, 괴사, 네크로토시스, 호중구 세포외 함정(NETs) 및 파이롭토시스를 포함한 다양한 형태의 세포 사멸 중에 방출된다. 이 세포 죽음의 측정은 세포 사멸의 다른 생화확적인 양식을 확인하는 데 필요한 몇몇 다른 biomarkers와 함께 시간이 많이 걸립니다. ecDNA의 측정은 일반적으로 병리학적 상해가 발생하는 실제 표적 기관이 아닌 신장 손상에 대한 대리로서 혈청 및 소변에서 수행됩니다. 신장에서 ecDNA를 조사하는 현재 어려움은 실험적으로 그리고 보관된 인간 신장 생검에서 포르말린 고정 파라핀 임베디드 조직 (FFPE)을 위한 방법의 부족입니다. 이 프로토콜은 FFPE 조직(인간과 뮤린 모두)에서 ecDNA에 대한 염색에 필요한 단계를 요약하여, 자동 불피를 해소하고 공개적으로 이용 가능한 오픈 소스 ImageJ 플러그인 Trainable Weka 세분화에서 기계 학습 도구를 사용하여 결과 이미지에서 ecDNA를 측정합니다. 훈련 가능한 Weka 세분화는 프로그램이 ecDNA를 분류하는 법을 배우는 글로메룰리 내의 ecDNA에 적용됩니다. 이 분류기는 후속 획득 신장 이미지에 적용되어 각 개별 이미지의 수동 주석이 필요하지 않습니다. 훈련 가능한 Weka 세분화의 적응성은 항MPO GN에 대한 일반적인 병리학 적 기여자 인 NETs 및 ecMPO를 식별하기 위해 실험적인 뮤린 항 MPO 구종염 (GN)에서 신장 조직에서 더 입증됩니다. 이 방법은 훈련 가능한 Weka 세분화 프로그램이 건강한 정상 신장 조직과 병들인 신장 조직 사이 ecDNA를 구별할 수 있는 효험을 명확하게 보여주는 신장 조직에서 ecDNA의 객관적인 분석을 제공합니다. 이 프로토콜은 다른 장기에서 ecDNA, NET 및 ecMPO를 식별하도록 쉽게 조정할 수 있습니다.
Introduction
골수페록시다아제 항호성 세포질항체 관련 혈관염(MPO-AAV)은 상당한 세포 사멸과 탈옥리보핵산(DNA)1,,2의방출로 병리학적 사구체 손상으로부터 신부전을 초래하는 자가면역 질환이다. DNA는 위험 신호로 작용하여 면역 계통을 활성화할 수 있습니다. 정상적인 건강 한 조건에서, DNA의 핵 위치는 면역 체계에 노출에서 보호를 제공. 병원성 과정 또는 자가면역 중에 세포외적으로 방출되는 자가 DNA는 면역 계통에 의해 강력한 염증 손상과 관련된 분자 자가 단백질(DAMP) 3으로 볼 수있다. 엑스트라 세포 DNA(ecDNA)는 세포 사멸, 네크로토시스 호중구 세포 외 트랩 형성 (NETs), 괴사 또는 발열체44, 5,56,6,7,,8과같은 뚜렷한 생화학적 경로에 의해 조절되는 몇 가지 뚜렷한 메커니즘을 통해 죽어가는 세포에서 방출된다.
본 명세서에서는 MPO-AAV9,,10을가진 환자로부터 실험적인 항MPO GN 및 신장 생검으로부터 포르말린 고정 파라핀 임베디드(FFPE) 신장의 섹션에서 죽어가는 세포로부터 방출되는 ecDNA를 염색하고 측정하는 방법을 설명한다. 혈청과 소변 모두에서 이중 좌초 DNA(dsDNA) 및 DNA 복합체를 순환하는 검출을 위한 여러 가지 방법이 존재하며, 체외 내검사서(11,,12)에서존재한다. 이러한 방법은 ecDNA의 양을 결정하는 데 정확하지만 ecDNA가 해부학적으로 방출되는 위치를 결정하지 는 않습니다. 세포 사멸을 위한 튜클과 같은 ecDNA의 특정 측정을 기술하고 세포이물질(13,,14)의측정을 설명하는 방법이 있다. 병리학적 손상이 발생하는 FFPE 신장의 모든 형태의 세포 사멸에서 절정에 달하는 ecDNA를 측정하는 방법을 설명하는 방법은 없습니다. 이것은 실험적인 치료 처리가 실제 표적 기관에 있는 병리학적인 상해의 사이트에서 ecDNA를 지우는지 결정하는 것이 중요합니다.
신장 샘플에서 여러 이미지를 수집하면 단일 사용자가 일반적으로 분석하는 대량의 데이터가 생성됩니다. 이는 노동 집약적이고 시간이 많이 소요되며 사용자 편향으로 인해 다른 사용자가 신뢰할 수 없는 재현성을 받을 수 있습니다. Trainable Weka 세분화는 최첨단 생물정보 도구를 사용하여 기계 학습 알고리즘15,,16을사용하여 픽셀을 분류하는 ImageJ용 오픈 소스 소프트웨어 플러그인입니다. 이 메서드는 픽셀 세그먼트의 사용자 분류에서 학습 하 고 다른 이미지에 새로운 학습 분류를 적용 하는 “교육 가능”. 이 메서드는 세그먼트의 각 픽셀을 특정 “클래스”에 속하는 것으로 “분류”하는 데 사용되는 ImageJ 프로그램 내의 일반적인 분석 도구에 의존합니다. 프로그램이 “분류자”를 알게 되면 동일한 이미지 내에서 다른 유사한 분류 세그먼트를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 그런 다음 이 모델을 저장하여 동일한 실험 내의 다른 이미지 집합에 적용됩니다.
신장 단면도에서 ecDNA를 결정하는 현재 장애물은 포르말린의 고정및 심상에 있는 노동 집약적인 분석에서 내인성 자동 형광입니다. 우리는 이 자동 형광을 담금질하고, ecDNA를 검출하고, ecDNA의 높은 처리량 측정을 위해 감독된 기계 학습을 사용하는 방법을 여기에서 설명합니다. 우리는 이전에 ImageJ에서 매크로를 사용하여 NET및 세포 외 MPO (ecMPO)의 측정을 발표했습니다, 우리는 지금 감독 기계 학습1을사용하여 이러한 방법의 반 자동화를 시연한다. 우리는 동일한 이미지 내에서 NET 및 ecMPO에 대한 대체 얼룩을 분류하기 위해 기계 학습 도구의 적응성을 보여줍니다. ecDNA, NET및 ecMPO를 검출하기 위해 여기에 기재된 이러한 염색 방법은 ecDNA, NETS 및 ecMPO가 류마티스 관절염 및 루푸스17,,18과같은 질병을 영속시키는 데 중요한 역할을 하는 다른 고체 장기 및 질병으로 번역될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
구종염의 환자 및 마우스 모델 모두의 혈청 및 소변에서 염증 성 마커를 측정하는 다중 프로토콜이 존재합니다. 이 설명된 프로토콜은 사구체 내세포사(ecDNA, NETs 및 ecMPO)의 제품을 직접 분석할 수 있게 한다. 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 조직 준비 및 이미징입니다. 분석을 위한 형광 염색 방법을 사용하는 주요 제한 요소는 조직 자가형광입니다. 포르말린 고정 파라핀 조직은 특정 형광 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 니콘 C1 직립 공초점 레이저 스캐닝 현미경과 신장 조직의 처리를위한 모나시 조직학 플랫폼의 사용에 대한 모나시 마이크로 이미징을 인정합니다.
Materials
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A2153 | 5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed. |
| Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-21468 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-121468 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-21441 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken sera | SIGMA | C5405 | Made up in 1%BSA/PBS |
| Coverslips 24 x60 mm | Azerscientific | ES0107222 | #1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy |
| EDTA 10mM | SIGMA | E6758 | Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution |
| Ethanol 30%, 70% and 100% | Chem Supply | UN1170 | Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water |
| Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin) | TRAJAN | NBF-500 | Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood |
| Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25×75 x1.0mm | TRAJAN | J3800AM4 | Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step |
| Goat anti human/mouse MPO antibody | R&D | AF3667 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Histosol | Clini Pure | CPL HISTOSOL 08 | Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood |
| Hydrophobic pen | VECTOR Labs | H-400 | Use to draw circle around kidney tissue |
| Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4) | ABCAM | ab128086 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope | Coherent Scientific | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA | P38135 | 0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time |
| Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless | Tefal | GSA-P2530738 | Purchased at local homeware store |
| Prolong Gold DAPI | Life Technologies | P36962 | Apply drops directly to coverslip |
| Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody | ABCAM | ab8227 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody | ABCAM | ab5103 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Staining rack 24 slides | ProScitech | H4465 | Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven |
| Sudan Black B | SIGMA | 199664 | 0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature |
| Tris 10mM | SIGMA | T4661 | Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution |
| Xylene | Trajan | XL005/20 | Must be use used in a fume hood |
References
- O’Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
- Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis. Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).
- Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. Programmed cell death as a defence against infection. Nat Rev Immunol. 17 (3), 151-164 (2017).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Wyllie, A. H., Kerr, J. F., Currie, A. R. Cell death: the significance of apoptosis. International Review of Cytology. 68, 251-306 (1980).
- Fiers, W., Beyaert, R., Declercq, W., Vandenabeele, P. More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage. Oncogene. 18 (54), 7719-7730 (1999).
- Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
- Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cellular Microbiology. 8 (11), 1812-1825 (2006).
- Ooi, J. D., Gan, P. Y., Odobasic, D., Holdsworth, S. R., Kitching, A. R. T cell mediated autoimmune glomerular disease in mice. Current Protocols in Immunology. 107, 15.27.11-15.27.19 (2014).
- Ruth, A. J., et al. Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).
- Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).
- Burnham, P., et al. Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract. Nature Communications. 9 (1), 2412 (2018).
- Gobe, G. Identification of apoptosis in kidney tissue sections. Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).
- Olander, M., Handin, N., Artursson, P. Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis. Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).
- Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases. Nature Reviews Rheumatology. 14 (8), 467-475 (2018).
- Chapman, E. A., et al. Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus. Frontiers in Immunology. 10, 423 (2019).
- Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histology & Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).
- Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).
- Schreiber, A., et al. Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).
- Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis. Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).
