Måling af afgrødemotilitet og madpasaging i Drosophila

Summary

Målet med denne protokol er at måle afgrøde sammentrækning og kvantificere fødevaredistribution i Drosophila gut.

Abstract

De fleste dyr bruger mave (GI) tarmkanalen til at fordøje mad. Bevægelsen af den indtagede mad i mave-tarmkanalen er afgørende for optagelse af næringsstoffer. Uorganiseret GI motilitet og gastrisk tømning forårsage flere sygdomme og symptomer. Som en kraftfuld genetisk model organisme, Drosophila kan bruges i GI motilitet forskning. Drosophila afgrøde er et organ, der kontrakter og flytter mad ind i midgut for yderligere fordøjelse, funktionelt ligner et pattedyr mave. Præsenteret er en protokol til at studere Drosophila afgrøde motilitet ved hjælp af simple måleværktøjer. En metode til optælling af afgrødesammentrækninger til vurdering af afgrødemotilitet og en metode til påvisning af fordelingen af fødevarer farvet blå mellem afgrøden og tarmen ved hjælp af et spektrofotometer til at undersøge afgrødens indvirkning på madpasning er beskrevet. Metoden blev anvendt til at påvise forskellen i afgrødemotilitet mellem kontrol- og nprl2-mutantfluer. Denne protokol er både omkostningseffektiv og meget følsom over for afgrøde motilitet.

Introduction

De fleste dyr har et fordøjelsesrør kaldet mave (GI) tarmkanalen til at absorbere energi og næringsstoffer fra miljøet. Den menneskelige mave-tarmkanalen er sammensat af fire dele: spiserøret, mave, tyndtarmen, og tyktarmen (tyktarmen). Mad passage fra maven til tarmen er afgørende for optagelse af næringsstoffer. Nogle effektorer, såsom aldring, giftige stoffer, og infektion, forårsage uordnede mave-tarmkanalen motilitet og gastrisk tømning, som er relateret til nogle sygdomme og deres symptomer såsom dyspepsi, gastroøsofageal refluks sygdom, og forstoppelse¹.

Frugtfluen(Drosophila melanogaster)er et udbredt modeldyr i biomedicinsk forskning på grund af sin nemme genetiske manipulation. Vigtigere, omkring 77% af gener forbundet med sygdomme hos mennesker har en homolog i Drosophila². Forskning ved hjælp af Drosophila har gjort enorme fremskridt i vores forståelse af mange sygdomsmekanismer. Som en kraftfuld genetisk model organisme, Drosophila er meget udbredt i mave-tarmkanalen forskning³. Drosophila har en enklere fordøjelseskanalen, som er opdelt i tre diskrete domæner: foregut, midgut, og hindgut⁴. Afgrøden, en del af foregut, er en pose-lignende struktur, der tjener som et sted for indtages opbevaring af fødevarer. Midgut er et langt rør og fungerer som stedet for fordøjelse af fødevarer og næringsstof absorption gennem epitellaget, som består af absorptive enterocytter (ECs) og sekretoriske enteroendokrine (EE) celler⁵. Interessant, maven funktion i Drosophila er opdelt i to dele: afgrøden fungerer som opbevaring af fødevarer og kobbercelle region (CCR) er en meget sur region med en pH < 3⁶. I Drosophilaflyttes den indtagede mad i første omgang til afgrøden og pumpes derefter ind i midgut⁷. Således afgrøden spiller en afgørende rolle i fødevarer passaging. Indhyllet af viscerale muskler og bestående af en kompleks vifte af ventiler og lukkemuskel, afgrøden holder ordregivende og flytte mad ind i midgut for yderligere fordøjelse.

Denne protokol giver mulighed for påvisning af fødevarer bevægelse fra afgrøden til midgut i Drosophila. Beskæring evalueres ved at tælle afgrødesammentrækningsfrekvensen. Desuden undersøges afgrødens indvirkning på overpasning af fødevarer ved påvisning af fødevarefordelingen mellem afgrøde og tarm. Desuden kan fødevaredistributionen bruges til at afspejle øjeblikkelig fødevarebevægelse eller grundlæggende fødevarestatus ved hjælp af forskellige fodringsperioder. Tilsammen giver denne protokol metoder til hurtigt at evaluere afgrøde motilitet og mad passaging i Drosophila.

Protocol

1. Vedligeholdelse og forberedelse af forsøgsfluer Vedligehold fluer i hætteglas indeholdende 10 ml frisklavet mad (1% agar, 2,4% ølgær, 3% saccharose, 5% majsmel) i en inkubator ved 25 °C med 60% fugtighed. Indstil inkubatorens lyscyklus til 12-h lys:12-h mørk. For at sikre, at et stort antal af de ønskede genotypefluer ekskluderer samtidigt, flyver kultur unge (1-3 dage gamle) i standardfødevarer med tørgær på overfladen i 3 dage. Overfør de voksne til en ny fødevare hætteglas med stan…

Representative Results

Disse metoder til at tælle afgrøde sammentrækning sats og opdage farvet fødevarer distribution kan bruges til at evaluere afgrøde funktion på fødevarer motilitet. Afgrøden sammentrækning afspejler hyppigheden af at skubbe fødevarer i tarmen. Fordelingen af farvestof i fluen efter en kort fodringsperiode indikerer øjeblikkelig madpassaging fra afgrøde til midgut. Mål for rapamycin kompleks 1 (TORC1) er en mester regulator, der formidler næringsstoffer og cellemetabolisme. TORC1 h?…

Discussion

I Drosophila indtages mad bevæger sig fra afgrøden til tarmen for fordøjelsen. Under denne proces, er næringsstofferne absorberes, og affaldet er udvist ud af kroppen som afføring. Således, sammenligne mad indtagelse sammen med afføring udslyngning kan bruges til groft at vurdere hastigheden af fødevarer bevægelse i kroppen. Metoden til kapillær feeder (CAFE) er almindeligt anvendt til at måle mad indtagelse^10,11. Metoden til afføring nummer …

Materials

96-well plate	Thermo fisher	269620
Brillant Blue FCF	Solarbio	E8500	also called FD&C Blue No. 1
Centrifuge	Thermo fisher	Heraeus Pico 17
Spectrophotometer	Spectra Max	cMax plus
Tweezers	Dumont	11252-30