Différenciation neuronale des cellules souches embryonnaires de souris in vitro

Résumé

Ici, nous avons établi une méthode peu coûteux et facile à utiliser qui dirige la différenciation rapide et efficace des cellules souches embryonnaires en neurones. Cette méthode convient à la vulgarisation entre les laboratoires et peut être un outil utile pour la recherche neurologique.

Résumé

La différenciation neuronale des cellules souches embryonnaires de souris (MESCs) est un outil potentiel pour élucider les mécanismes clés impliqués dans la neurogenèse et potentiellement aider à la médecine régénérative. Ici, nous avons mis en place une méthode efficace et peu coûteux pour la différenciation neuronale des MESCs in vitro, en utilisant la stratégie de dépistage combinatoire. Dans les conditions définies ici, la formation du corps embryoïde de 2 jours + protocole d’induction de l’acide rétinoïque de 6 jours permet une différenciation rapide et efficace des MESC en cellules précurseurs neuronales (PNJ), comme en est la formation d’A2lox bien empilés et neurites et de 129 dérivés positifs à Nestin. L’état sain des corps embryoïdes et le moment où l’acide rétinoïque (PR) est appliqué, ainsi que les concentrations de PR, sont essentiels dans le processus. Dans la différenciation subséquente des PNJ en neurones, N2B27 medium II (complété par le milieu neurobasal) pourrait mieux soutenir le maintien et la maturation à long terme des cellules neuronales. La méthode présentée est très efficace, peu coûteux et facile à utiliser, et peut être un outil puissant pour la neurobiologie et la recherche en biologie du développement.

Introduction

Les cellules souches embryonnaires (ESC) sont pluripotentes et peuvent se différencier en cellules précurseurs neuronales (PNJ) puis en neurones dans certaines conditions¹. La neurogenèse basée sur l’ESC fournit la meilleure plate-forme pour imiter la neurogenèse, servant ainsi d’outil utile pour des études de biologie développementale et potentiellement aider à la médecine^{régénérative 2,3}. Au cours des dernières décennies, de nombreuses stratégies ont été rapportées pour induire la neurogenèse embryonnaire, comme la méthode transgénique⁴, en utilisant de petites....

Protocole

1. Culture embryonnaire de cellules souches de souris

1. Préparer 0,1 % de plats ou d’assiettes de culture cellulaire enduits de gélatine.
   1. Ajouter 2 mL de gélatine stérilisée à 0,1 % (0,1 % w/v dans l’eau) aux plats de culture cellulaire de 60 mm. Rock doucement pour assurer un enduit même des plats de culture cellulaire.
   2. Mettre les plats dans un incubateur de CO_{2 à} 5% à 37 °C et laisser le revêtement pendant 1 h.
   3. Retirer la solution gélatineuse de 0,1 % avant d’ensemencer les cellules.
      REMARQUE : Après avoir enlevé la gélatine, il n’est pas nécessaire de sécher ou de laver la vaisselle enduite.

Résultats

La formation de corps embryoïde de 2 jours + l’induction de RA de 6 jours fonctionne mieux sur la direction de la différenciation des MESCs dans les PNJ (phase I). Afin de déterminer le protocole optimal qui favorise le mieux la différenciation des MESC en PNJ (phase I), 7 protocoles ont été testés sur a2lox et 129 mESC(tableau 1)et l’état de différenciation de chaque groupe a été surveillé au microscope léger. Comme le montre la figure 3A, la plupart des dérivés de l’A2lox .......

Discussion

Dans la présente étude, nous avons établi une méthode simple et efficace pour la différenciation neuronale des MESCs, avec des matériaux peu coûteux et facilement obtenus. Dans cette méthode, 2 jours de formation du corps embryoïde suivis de 6 jours d’induction de la PR peuvent effectivement favoriser la différenciation des MESC en PNJ (phase I-protocole 3). Pour la différenciation de phase II, N2B27 medium II (Phase II-protocol 3) induit le plus efficacement la différenciation des PNJ en neurones. Pour assurer le succès.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anticorps anti-Nestine [Rat-401]	Abcam	Ab11306	stocké à -80 ° ; C, éviter la congélation et la décongélation répétées
l’anticorps anti-&bêta ;-tubuline III produit chez le lapin	Sigma Aldrich	T2200	stocké à -80 ° ; C, évitez la congélation et la décongélation répétées
Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG	Beyotime	A0428	stocké à -20 ° ; C et protéger de la lumière
B-27 Supplément (50X), sérum Gibco 17504044 stocké			à -20 ° ; C, et protéger de la lumière
CHIR-99021 (CT99021)	Selleck	S1263	stocké à -20 ° ; C
Lamelles	NEST	801007
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0516	stocké à -20 ° ; C et protéger de la lumière
DME/F-12 1:1 (1x)	HyClone	SH30023.01B	stocké à 4 ° ; C
Sérum fœtal bovin	HyClone	SH30084.03	stocké à -20 ° ; C, éviter la congélation et la décongélation répétées
Microscopie à fluorescence	Olympus	CKX53
Gélatine	Gibco	CM0635B	conservée à température ambiante
Supplément GlutaMAX Gibco		35050061	conservée à 4 ° ; C
Immunol Staining Primaire Tampon de dilution des anticorps	Beyotime	P0103	stocké à 4 ° ; C
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	12660012	stocké à 4 ° ; C
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028	stocké à -20 ° ; C, éviter la congélation et la décongélation répétées
de la leucémie Facteur inhibiteur humain	Sigma	L5283	stocké à -20 ° ; C
Support de montage avec DAPI - Aqueux, Fluoroshield	Abcam	AB104139	stocké à 4 ° ; C et protéger de la lumière
MEM Solution d’acides aminés non essentiels	Gibco	11140076	stockée à 4 ° ; C
N-2 Supplément (100X)	Gibco	17502048	stocké à -20 ° ; C et protéger de la lumière
Sérum de chèvre normal	Jackson	005-000-121	stocké à -20 ° ; C
Neurobasal Medium	Gibco	21103049	stocké à 4 ° ; C
Boîte bactérienne non adhésive	Corning	3262
Saline tamponnée au phosphate (1X)	HyClone	SH30256.01B	stockée à 4 ° ; C
Pénicilline/Streptomycine Solution	HyClone	SV30010	conservé à 4 ° ; C
PD0325901(Mirdametinib)	Selleck	S1036	stocké à -20 ° ; C
Acide rétinoïque	Sigma	R2625	stocké à -80 ° ; C et protéger de la lumière
Souche 129 Cellules souches embryonnaires de souris	Cyagen	MUAES-01001	Maintenu dans un système de culture sans feeder
Stem-Cellbanker (sans DMSO)	ZENOAQ	stem cellbanker sans DMSO	stocké à -20 ° ; C, éviter la congélation et la décongélation répétées
de la trypsine à 0,25 % (1X) Solution	HyClone	SH30042,01	stockée à 4 ° ; C
Triton X-100	Sigma	T8787
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	stocké à 4 ° ; C et protéger de la lumière
4 % de paraformaldéhyde	Beyotime	P0098	stocké à -20 ° ; C
6 - plaque à puits	Corning	3516
Plat de culture cellulaire de 60 mm	Corning	430166
tube à centrifuger de 15 ml	NUNC	339650

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