In Vivo Quantification du chiffre d’affaires des protéines dans le vieillissement C. Elegans à l’aide de Photoconvertible Dendra2

Résumé

Présenté ici est un protocole pour surveiller la dégradation de la protéine huntingtine fusionnée au fluorophore photoconvertible Dendra2.

Résumé

Les protéines sont synthétisées et dégradées constamment dans une cellule pour maintenir l’homéostasie. Être capable de surveiller la dégradation d’une protéine d’intérêt est essentiel pour comprendre non seulement son cycle de vie, mais aussi pour découvrir les déséquilibres dans le réseau de protéostase. Cette méthode montre comment suivre la dégradation de la huntingtine protéique causant la maladie. Deux versions de huntingtine fusionnées à Dendra2 sont exprimées dans le système nerveux de C. elegans : une version physiologique ou une avec une étendue étendue et pathogène de glutamines. Dendra2 est une protéine fluorescente photoconvertible; sur une courte impulsion d’irradiation ultraviolette (UV), Dendra2 passe de vert à rouge ses spectres d’excitation/émission. Semblable à une expérience de chasse à l’impulsion, le chiffre d’affaires du red-Dendra2 converti peut être surveillé et quantifié, indépendamment de l’interférence de la nouvelle synthèse verte-Dendra2. À l’aide de la microscopie confocale et de la transparence optique de C. elegans,il est possible de surveiller et de quantifier la dégradation de huntingtin-Dendra2 dans un organisme vivant et vieillissant. La huntingtine neuronale-Dendra2 est partiellement dégradée peu après la conversion et effacée plus loin au fil du temps. Les systèmes contrôlant la dégradation sont déficients en présence de huntingtine mutante et sont encore altérés par le vieillissement. Les sous-types neuronaux du même système nerveux présentent des capacités de rotation différentes pour huntingtin-Dendra2. Dans l’ensemble, la surveillance de toute protéine d’intérêt fusionnée à Dendra2 peut fournir des informations importantes non seulement sur sa dégradation et les acteurs du réseau de protéostase impliqués, mais aussi sur son emplacement, le trafic et le transport.

Introduction

Le protéome d’un organisme vivant se renouvelle constamment. Les protéines sont continuellement dégradées et synthétisées en fonction de la demande physiologique d’une cellule. Certaines protéines sont rapidement éliminées, tandis que d’autres sont plus longues. La surveillance de la dynamique des protéines est une tâche plus simple, plus précise et moins invasive lors de l’utilisation de protéines fluorescentes génétiquement codées (FP). Les RP se forment automatiquement et peuvent être fusionnés à n’importe quelle protéine d’intérêt (POI), mais n’ont pas besoin d’enzymes pour plier ou ont besoin de cofacteurs sauf pour l’oxygène¹. Une nouvell....

Protocole

1. Génération de C. elegans exprimant la protéine de fusion neuronale Huntingtin-Dendra2

1. Clonez le gène codant le POI dans un vecteur d’expression nématode (c.-à-d. pPD95_75, Addgene #1494), par l’enzyme de restriction traditionnelle digest¹⁰, Gibson assembly¹¹, ou n’importe quelle méthode de choix. Insérez un promoteur pour conduire l’expression dans un tissu désiré ou à un stade de développement souhaité. Insérez le fluorophore Dendra2 en phase terminale N ou C avec le POI.
2. Générer transgénique C. elegans exprimant la construction de fusion (par exemple, par microinjection)

Résultats

Deux souches de nématode exprimant le fragment de protéine de huntingtine exon-1 dans le cadre avec la protéine photoconvertitible Dendra2 ont été obtenues par microinjection et les plasmides ont été conservés comme un tableau extrachromosomique. La construction de fusion a été exprimée dans l’ensemble du système nerveux de C. elegans du développement tout au long du vieillissement. Ici, HTT-D2 contenait soit l’étirement physiologique de 25 polyglutamine (HTTQ25-D2,

Discussion

Pour comprendre la fonction d’une protéine, il est important de comprendre sa synthèse, son emplacement et sa dégradation. Avec le développement de FP nouveaux, stables et brillants, la visualisation et la surveillance des POI sont devenues plus faciles et plus efficaces. Les PAFP de fusion génétiquement exprimés comme Dendra2 sont particulièrement bien placés pour étudier la stabilité d’un POI. Lors de l’exposition à la lumière bleu pourpre, Dendra2 se brise à un endroit précis dans une triade d’acides aminés conservés........

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agar-Agar Kobe I	Carl Roth GmbH + Co. KG	5210.2	NGM
composant Agarose, Universal Grade	Bio & Sell GmbH	BS20.46.500	Montage de la glissière
BD Bacto Peptone	BD-Bionsciences	211677	NGM
composant Deckglä ; ser-18x18mm	Carl Roth GmbH + Co. KG	0657.2	Couvercles
EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27	Carl Zeiss AG		Objectif
Fidji/ImageJ 1.52p	NIH		Logiciel d’analyse
Chlorhydrate de lévamisole	AppliChem GmbH	A4341	Anesthésique
LSM710-ConfoCor3	Carl Zeiss AG		Balayage laser Micoscope confocal
Microscope de montage	Leica Camera AG		Microscope de montage
neuronal-HTTQ25-Dendra2	cet article		C. elegans souche
neuronal-HTTQ97-Dendra2	cet article		C. elegans souche
OP50 Escherichia coli	CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)	OP50	Source alimentaire de nématodes
Chlorure de sodium	Carl Roth GmbH + Co. KG	3957.2	NGM
composant Standard-Objektträ ; ger	Carl Roth GmbH + Co. KG	0656.1	Lames en verre
ZEN2010 B SP1	Carl Zeiss AG		Logiciel d’acquisition confocale