Detta protokoll möjliggör differentiering av humana pluripotenta celler till tarmorganoider. Protokollet efterliknar normal mänsklig utveckling genom att differentiera celler till en population av definitiv endoderm, baktarmsendoderm och sedan tarmepitel. Detta gör protokollet lämpligt för att studera både tarmutveckling och sjukdomsmodelleringstillämpningar.
hiPSC-härledda tarmorganoider är epitelstrukturer som självorganiserar sig från differentierade celler till komplexa 3D-strukturer, representativa för det mänskliga tarmepitelet, där de uppvisar krypta/villusliknande strukturer. Här beskriver vi genereringen av hiPSC-härledda tarmorganoider genom den stegvisa differentieringen av hiPSCs till definitiv endoderm, som sedan posterioriseras för att bilda baktarmsepitel innan den överförs till 3D-odlingsförhållanden. 3D-odlingsmiljön består av extracellulär matris (ECM) (t.ex. Matrigel eller annan kompatibel ECM) kompletterad med SB202190, A83-01, Gastrin, Noggin, EGF, R-spondin-1 och CHIR99021. Organoider genomgår passering var 7:e dag, där de störs mekaniskt innan de överförs till färsk extracellulär matris och tillåts expandera. QPCR och immunocytokemi bekräftar att hiPSC-härledda tarmorganoider innehåller mogna tarmepitelcelltyper inklusive bägarceller, Paneth-celler och enterocyter. Dessutom visar organoider tecken på polarisering genom uttryck av villin lokaliserad på epitelcellernas apikala yta.
De resulterande organoiderna kan användas för att modellera mänsklig tarmutveckling såväl som många mänskliga tarmsjukdomar inklusive inflammatorisk tarmsjukdom. För att modellera tarminflammation kan organoider utsättas för inflammatoriska mediatorer som TNF-α, TGF-β och bakteriell LPS. Organoider som exponerats för proinflammatoriska cytokiner uppvisar en inflammatorisk och fibrotisk fenotyp som svar. Att para ihop friska kontra hiPSCs som härrör från patienter med IBD kan vara användbart för att förstå mekanismer som driver IBD. Detta kan avslöja nya terapeutiska mål och nya biomarkörer för att hjälpa till med tidig sjukdomsdiagnos.
Egenskaperna hos pluripotenta stamceller (PSC), såsom självförnyelse och förmågan att differentiera till vilken celltyp som helst i människokroppen, gör dem till värdefulla verktyg i studiet av utveckling, sjukdomspatologi och läkemedelstestning1. Humana inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) är särskilt användbara för sjukdomsmodelleringsstudier eftersom de kan härledas från patienter och direkt fånga genomet som är ansvarigt för sjukdomens fenotyp 2,3. Sådana hiPSCs kan differentieras till den celltyp som påverkas av den genetiska defekten, vilket möjliggör noggrann undersökningav sjukdomens molekylära mekanism.
Differentieringsprotokoll för humana PSC:er syftar till att styra differentieringen av celler via de viktigaste utvecklingsstadierna genom aktivering eller hämning av specifika signalvägar som styr härstamningsåtagande och specifikation. Upprätthållande av hiPSC i ett pluripotent tillstånd kräver måttliga nivåer av Activin A (Act-A)-signalering, medan en hög dos av Act-A i 3 dagar binder hiPSC till ett definitivt endoderm (DE) öde 5,6. Act-A- och Wnt-vägar styr den främre-bakre identiteten hos DE. Signalering med Act-A inducerar markörer för framtarmen (FG) som HHEX, HNF4α och GATA4, samtidigt som uttrycket av grovtarmsgener (HG) som CDX2 blockeras. Wnt-signalering inducerar posteriorisering av DE, som sedan antar en HG-genuttrycksprofil 7,8. När HG-cellens identitet har fastställts kan differentieringen flyttas från 2D till 3D och riktas mot bildandet av tarmorganoider.
Tarmorganoider odlas vanligtvis i ett 3D-extracellulärt matrissystem (t.ex. Matrigel eller andra kompatibla ECM) baserat på odlingssystem9, bestående av laminin, kollagen IV och entaktin och berikat med tillväxtfaktorer som EGF, FGF, PDGF och IGF-1 för att bidra till överlevnad och spridning. Organoiderna odlas i ett definierat medium som innehåller Gastrin, Noggin och CHIR för att stimulera och stödja tarmstamcellstillväxt och proliferation under långtidsodling.
Efter att tarmepitelceller har bäddats in i den extracellulära matrisen börjar tarmkryptor bildas och expandera och bildar så småningom sfäroider. Dessa mognar till organoidstrukturer som efterliknar fysiologisk funktion av tarmepitel. Organoider kan vanligtvis odlas i mer än 1 år utan betydande förlust av funktionella och genuttrycksprofiler. Passage krävs varje vecka med hjälp av enzymatisk nedbrytning av organoiderna i mindre fragment som sedan självsätter ihop till kompletta organoider.
Etablerade organoidlinjer kan användas som en tillförlitlig modell av många sjukdomar kopplade till tarmen, inklusive Crohns sjukdom, ulcerös kolit och kolorektal cancer 10,11,12,13. Detta är en modell som föredras framför djurceller eftersom de uttrycker mänskliga gener som är kopplade till dessa sjukdomar och reagerar på yttre stimuli som mer liknar det som förekommer i mänsklig vävnad in vivo.
Här beskriver vi ett protokoll för differentiering av humana pluripotenta celler till humana tarmorganoider. Vi demonstrerar deras användning för att studera inflammation; Detta kan dock tillämpas i olika sammanhang, och i kombination med CRISPR/Cas9-genredigeringsmetoder14, på vilken genetisk bakgrund som helst. När de väl har differentierats, efter den naturliga utvecklingsdifferentieringssekvensen av definitiv endoderm, endoderm i baktarmen och sedan tarmepitel, kan de resulterande organoiderna kontinuerligt odlas och passera i mer än 12 månader.
En kritisk aspekt av detta protokoll är den initiala pläteringstätheten av odifferentierade stamceller före endodermdifferentiering. Om detta inte optimeras tillräckligt kommer cellerna sannolikt att dö under det initiala DE-differentieringssteget (om cellerna är för glesa) eller minska effektiviteten av DE-differentieringen (om cellerna är för täta). Den korrekta startdensiteten måste optimeras för den cellinje som används, och den korrekta densiteten bör generera ett monolager i slutet av DE D3. Flödescytometri bör användas för att bestämma effektiviteten av DE-specifikationen och vi ser vanligtvis >80 % av cellerna positiva för SOX17 och/eller CXCR4. När antalet SOX17-positiva celler är mindre än 60 % påverkas effektiviteten av HG-mönstring, vilket resulterar i att färre organoider bildas när de överförs till den extracellulära matrisen. Detta kommer i slutändan att leda till att de resulterande organoidkulturerna misslyckas. För att avgöra om mönstring av DE till HG har varit framgångsrikt, bedömer vi antalet CDX2-positiva celler genom flödescytometri och förväntar oss vanligtvis att se >80 % positiva celler. Återigen, om antalet CDX2-positiva celler sjunker under 50 % kommer detta att ha en negativ effekt på antalet tarmorganoider som genereras när de överförs till 3D extracellulär matriskultur.
Efter överföring av 2D-monolager till 3D-kultur bör små kompakta sfärer framträda 24-48 timmar efter överföringen. Stora ark av döda celler kan uppstå beroende på differentieringseffektiviteten för den cellinje som används. Istället för att omedelbart passera kulturer för att ta bort dessa skräp, låter vi organoiderna fullt ut bildas och utveckla sin mer komplexa, veckade struktur. Att vänta 7-10 dagar innan du försöker den första passagen säkerställer att tillräckligt med delande celler finns för att generera många nya tarmorganoider. Eventuellt skräp som fortfarande finns kvar i kulturen kan enkelt avlägsnas under passageprocessen genom att långsamt snurra de dissocierade organoid/skräpblandningarna i ett rör med tillräcklig hastighet för att pelletera organoiderna men lämna cellark flytande i mediet. Media och cellulärt skräp kan sedan aspireras så att endast pelleten av organoider återstår.
Begränsningen med detta tillvägagångssätt är att hiPSC-härledda celltyper ofta inte är fullt mogna när det gäller genuttryck och funktionella profiler. För att avgöra om hiPSC-härledd tarmvävnad är lämplig för specifika applikationer bör organoiderna karakteriseras för olika celltyper inklusive enterocyter (VIL), enteroendokrina celler (neurog3), bägarceller (MUC2), transienta amplifierande celler (CD133), panethceller (FZD5) och LGR5+ stamceller (LGR5) för att bestämma organoidens cellulära sammansättning.
Sammantaget är den stora fördelen med detta protokoll jämfört med många andra organoiddifferentieringsprotokoll att denna odlingsplattform är mycket kostnadseffektiv på grund av ersättning av flera rekombinanta proteiner och konditionerade mediapreparat med små molekyler15,16. Differentieringen till HG är mycket enkel och snabb och kan tillämpas på både humana embryonala och inducerade pluripotenta stamceller med identiska resultat. När den följs noggrant och optimeras för de cellinjer som används ger den en relativt enkel modellplattform fri från kontaminerande mesenkymala celler som sedan kan användas för att studera tarmepitel i en mängd olika sammanhang, inklusive inflammation, värdpatogeninteraktioner7. Modellering av tarmfibros kan undersökas genom att tillhandahålla pro-fibrotiska stimuli och sedan bedöma uttrycket av extracellulära matrixproteiner såsom kollagen, laminin och fibronektin med QPCR, western blot och ELISA. Genom att använda CRISPR/Cas9-genredigeringstekniker på odifferentierade stamcellslinjer före differentiering kan man skapa genknockout eller organoider för proteinöveruttryck som kan användas för att skapa sjukdomsspecifika organoider och mer komplexa sjukdomsmodeller 14,17,18.
The authors have nothing to disclose.
NH finansieras av MRC (MR/S009930/1) och Wellcome Trust (204267/Z/16/Z), PD finansieras av MRC PhD DTP, KLF finansieras av BBSRC iCASE.
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Activin A | R&D | 338-AC | |
Advanced DMEM/F12 (1X) | Life Technologies | 12654-010 | |
B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
CHIR99021 | Sigma | SML1046-5MG | |
Epidermal Growth Factor | R&D Systems | 236-EG-01M | |
Gastrin | Sigma Aldrich | G9145 | |
GlutaMAX (100X) | Life Technologies | 15630-056 | |
Growth Factor reduced Matrigel | BD | ||
HEPES Buffer solution (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
N2 Supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
N-acetyl-cysteine | Sigma Aldrich | A7250 | |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
Noggin | R&D Systems | 6057-NG | |
Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
Paraformaldehyde | VWR | 9713.5 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
Retinoic Acid | Sigma | 302-79-4 | |
ROCK inhibitor | Tocris | 1254/1 | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
RPMI | Sigma | R8758-500ml | |
R-Spondin-1 | Peprotech | 120-38 | |
SB202190 | Tocris | 1264 | |
TrypLe Express | Gibco | 12604-021 | |
Wnt 3a | R&D | 5036-WN |