यह प्रोटोकॉल आंतों के ऑर्गेनोइड में मानव प्लुरिपोटेंट कोशिकाओं के भेदभाव के लिए अनुमति देता है। प्रोटोकॉल निश्चित endoderm की आबादी में कोशिकाओं को विभेदित द्वारा सामान्य मानव विकास की नकल, hindgut endoderm और फिर आंतों उपकला. यह प्रोटोकॉल दोनों आंतों के विकास के साथ ही रोग मॉडलिंग अनुप्रयोगों का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त बनाता है.
hiPSC-व्युत्पन्न आंतों के ऑर्गेनोइड उपकला संरचनाएं हैं जो विभेदित कोशिकाओं से जटिल 3 डी संरचनाओं में स्वयं-इकट्ठा होती हैं, मानव आंतों के उपकला के प्रतिनिधि, जिसमें वे क्रिप्ट / विलस जैसी संरचनाओं का प्रदर्शन करते हैं। यहां, हम निश्चित एंडोडर्म में एचआईपीएससी के चरणबद्ध भेदभाव द्वारा hiPSC-व्युत्पन्न आंतों के ऑर्गेनोइड की पीढ़ी का वर्णन करते हैं, जिसे तब 3D संस्कृति स्थितियों में स्थानांतरित करने से पहले हिंदगट एपिथेलियम बनाने के लिए पीछे रखा जाता है। 3 डी संस्कृति पर्यावरण बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) (जैसे, मैट्रिगेल या अन्य संगत ईसीएम) SB202190, ए 83-01, गैस्ट्रिन, नोगिन, ईजीएफ, आर-स्पोंडिन -1 और CHIR99021 के साथ पूरक होते हैं। ऑर्गेनोइड हर 7 दिनों में पासिंग से गुजरते हैं, जहां उन्हें ताजा बाह्य मैट्रिक्स में स्थानांतरित करने से पहले यंत्रवत् रूप से बाधित किया जाता है और विस्तार करने की अनुमति दी जाती है। क्यूपीसीआर और इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री पुष्टि करते हैं कि एचआईपीएससी-व्युत्पन्न आंतों के ऑर्गेनोइड में परिपक्व आंतों के उपकला सेल प्रकार होते हैं जिनमें गॉब्लेट कोशिकाएं, पैनेथ कोशिकाएं और एंटरोसाइट्स शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, ऑर्गेनोइड उपकला कोशिकाओं की शिखर सतह पर स्थानीयकृत विलिन की अभिव्यक्ति द्वारा ध्रुवीकरण के प्रमाण दिखाते हैं।
परिणामी ऑर्गेनोइड का उपयोग मानव आंतों के विकास के साथ-साथ सूजन आंत्र रोग सहित कई मानव आंतों के रोगों को मॉडल करने के लिए किया जा सकता है। आंतों की सूजन को मॉडल करने के लिए, ऑर्गेनोइड को टीएनएफ-α, टीजीएफ -β और बैक्टीरियल एलपीएस जैसे भड़काऊ मध्यस्थों के संपर्क में लाया जा सकता है। प्रिनफ्लेमेटरी साइटोकिन्स के संपर्क में आने वाले ऑर्गेनोइड प्रतिक्रिया में एक भड़काऊ और फाइब्रोटिक फेनोटाइप प्रदर्शित करते हैं। आईबीडी के रोगियों से प्राप्त स्वस्थ बनाम एचआईपीएससी की जोड़ी आईबीडी ड्राइविंग तंत्र को समझने में उपयोगी हो सकती है। यह प्रारंभिक रोग निदान में सहायता के लिए उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्यों और उपन्यास बायोमार्कर को प्रकट कर सकता है।
प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (पीएससी) के गुण, जैसे आत्म-नवीकरण और मानव शरीर के किसी भी सेल प्रकार में अंतर करने की क्षमता, उन्हें विकास, रोग विकृति और दवा परीक्षणके अध्ययन में मूल्यवान उपकरण बनाती है। मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (hiPSC) रोग मॉडलिंग अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी होते हैं क्योंकि उन्हें रोगियों से प्राप्त किया जा सकता है, सीधे रोग फेनोटाइप 2,3 के लिए जिम्मेदार जीनोम पर कब्जा कर सकते हैं। इस तरह के hiPSCs रोग 4 के आणविक तंत्र की सावधानीपूर्वक परीक्षा की अनुमति आनुवंशिक दोष से प्रभावित सेल प्रकार के लिए विभेदित किया जा सकताहै.
मानव पीएससी के लिए भेदभाव प्रोटोकॉल का उद्देश्य वंश प्रतिबद्धता और विनिर्देश को नियंत्रित करने वाले विशिष्ट सिग्नलिंग मार्गों के सक्रियण या निषेध द्वारा मुख्य विकास चरणों के माध्यम से कोशिकाओं के भेदभाव को निर्देशित करना है। एक pluripotent राज्य में hiPSC के रखरखाव Activin एक (अधिनियम-ए) संकेत के मध्यम स्तर की आवश्यकता है, जबकि अधिनियम एक के लिए एक उच्च खुराक 3 दिनों एक निश्चित endoderm करने के लिए hiPSC प्रतिबद्ध (DE) भाग्य 5,6. अधिनियम-ए और डब्ल्यूएनटी मार्ग डीई की पूर्वकाल-पश्च पहचान को निर्देशित करते हैं। एक्ट-ए द्वारा सिग्नलिंग HHEX, HNF4α और GATA4 जैसे फोरगट (FG) मार्करों को प्रेरित करता है, जबकि CDX2 जैसे हिंदगट (HG) जीन की अभिव्यक्ति को अवरुद्ध करता है। Wnt सिग्नलिंग DE के पोस्टीरियोराइजेशन को प्रेरित करता है, जो तब एक HG जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल 7,8 को अपनाता है। एक बार एचजी सेल पहचान स्थापित हो जाने के बाद, भेदभाव को 2 डी से 3 डी तक ले जाया जा सकता है और आंतों के ऑर्गेनोइड के गठन की ओर निर्देशित किया जा सकता है।
आंतों के ऑर्गेनोइड आमतौर पर एक 3 डी बाह्य मैट्रिक्स (जैसे, मैट्रिगेल या अन्य संगत ईसीएम) आधारित संस्कृति प्रणाली9 में सुसंस्कृत होते हैं, जिसमें लैमिनिन, कोलेजन IV और एंटेक्टिन शामिल होते हैं और ईजीएफ, एफजीएफ, पीडीजीएफ और आईजीएफ -1 जैसे विकास कारकों से समृद्ध होते हैं ताकि समर्थन अस्तित्व और प्रसार में योगदान दिया जा सके। ऑर्गेनोइड को गैस्ट्रिन, नोगिन और सीएचआईआर युक्त परिभाषित माध्यम में सुसंस्कृत किया जाता है ताकि दीर्घकालिक संस्कृति के दौरान आंतों के स्टेम सेल के विकास और प्रसार को उत्तेजित और समर्थन किया जा सके।
आंतों के उपकला कोशिकाओं को बाह्य मैट्रिक्स में एम्बेडेड होने के बाद, आंतों के क्रिप्ट बनने लगते हैं और अंततः स्फेरॉइड बनाने का विस्तार करते हैं। ये ऑर्गेनॉइड संरचनाओं में परिपक्व होते हैं जो आंतों के उपकला के शारीरिक कामकाज की नकल करते हैं। ऑर्गेनोइड को आमतौर पर कार्यात्मक और जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल के महत्वपूर्ण नुकसान के बिना 1 वर्ष से अधिक समय तक सुसंस्कृत किया जा सकता है। ऑर्गेनोइड के एंजाइमेटिक पाचन का उपयोग करके साप्ताहिक आधार पर पासिंग की आवश्यकता होती है, छोटे टुकड़ों में जो तब पूर्ण ऑर्गेनोइड में स्वयं-पुन: इकट्ठा होते हैं।
स्थापित ऑर्गेनॉइड लाइनों का उपयोग आंत से जुड़े कई विकारों के एक विश्वसनीय मॉडल के रूप में किया जा सकता है, जिसमें क्रोहन रोग, अल्सरेटिव कोलाइटिस और कोलोरेक्टल कैंसर10,11,12,13शामिल हैं। यह पशु कोशिकाओं के लिए एक पसंदीदा मॉडल है क्योंकि वे इन विकारों से जुड़े मानव जीन को व्यक्त करते हैं और बाहरी उत्तेजनाओं का अधिक बारीकी से जवाब देते हैं जो विवो में मानव ऊतक में होता है।
यहां, हम मानव आंतों के ऑर्गेनोइड में मानव प्लुरिपोटेंट कोशिकाओं के भेदभाव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम सूजन का अध्ययन करने के लिए उनके उपयोग का प्रदर्शन करते हैं; हालांकि, इसे विभिन्न संदर्भों पर लागू किया जा सकता है, और किसी भी आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 जीन संपादन दृष्टिकोण14 के साथ युग्मित किया जा सकता है। एक बार विभेदित होने के बाद, निश्चित एंडोडर्म, हिंदगट एंडोडर्म और फिर आंतों के उपकला के प्राकृतिक विकासात्मक भेदभाव अनुक्रम के बाद, परिणामी ऑर्गेनोइड को लगातार सुसंस्कृत किया जा सकता है और 12 महीने से अधिक समय तक पारित किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण पहलू endoderm भेदभाव से पहले undifferentiated स्टेम कोशिकाओं के प्रारंभिक चढ़ाना घनत्व है. यदि यह पर्याप्त रूप से अनुकूलित नहीं है, तो कोशिकाएं प्रारंभिक डीई भेदभाव चरण (यदि कोशिकाएं बहुत विरल हैं) के दौरान मर जाएंगी या डीई भेदभाव की दक्षता को कम कर देंगी (यदि कोशिकाएं बहुत घनी हैं)। सही प्रारंभिक घनत्व को सेल लाइन के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता है, और सही घनत्व को डीई डी 3 के अंत तक एक मोनोलेयर उत्पन्न करना चाहिए। डीई विनिर्देश की दक्षता निर्धारित करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग किया जाना चाहिए और हम आम तौर पर एसओएक्स 17 और / या सीएक्ससीआर 4 के लिए सकारात्मक कोशिकाओं का > 80% देखते हैं। जब SOX17 सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या 60% से कम होती है, तो HG पैटर्निंग की दक्षता प्रभावित होती है, जिसके परिणामस्वरूप बाह्य मैट्रिक्स में स्थानांतरित होने पर कम ऑर्गेनोइड बनते हैं। यह अंततः परिणामी ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों को विफल करने का कारण बनेगा। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या डीई से एचजी पैटर्निंग सफल रही है, हम प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा सीडीएक्स 2 सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या का आकलन करते हैं और आमतौर पर > 80% सकारात्मक कोशिकाओं को देखने की उम्मीद करते हैं। फिर, यदि सीडीएक्स 2 सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या 50% से कम हो जाती है, तो इसका आंतों के ऑर्गेनोइड की संख्या पर प्रतिकूल प्रभाव पड़ेगा जो 3 डी बाह्य मैट्रिक्स संस्कृति में स्थानांतरित होने पर उत्पन्न होते हैं।
3 डी संस्कृति में 2 डी मोनोलेयर के हस्तांतरण के बाद, छोटे कॉम्पैक्ट गोले हस्तांतरण के बाद 24-48 घंटे दिखाई देने चाहिए। उपयोग की जाने वाली सेल लाइन के लिए भेदभाव दक्षता के आधार पर मृत कोशिकाओं की बड़ी चादरें दिखाई दे सकती हैं। इन मलबे को हटाने के लिए संस्कृतियों को तुरंत पारित करने के बजाय, हम ऑर्गेनोइड को पूरी तरह से बनाने और उनकी अधिक जटिल, मुड़ी हुई संरचना को विकसित करने की अनुमति देते हैं। पहले गुजरने का प्रयास करने से पहले 7-10 दिनों तक प्रतीक्षा करना यह सुनिश्चित करता है कि कई नए आंतों के ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त विभाजन कोशिकाएं मौजूद हैं। संस्कृति में अभी भी मौजूद किसी भी मलबे को आसानी से पासिंग प्रक्रिया के दौरान आसानी से हटाया जा सकता है, धीरे-धीरे ऑर्गेनोइड को गोली मारने के लिए पर्याप्त गति के साथ एक ट्यूब में अलग-अलग ऑर्गेनॉइड / मलबे के मिश्रण को कताई करके लेकिन मीडिया में तैरती कोशिकाओं की शीट छोड़ दें। मीडिया और सेलुलर मलबे को तब महाप्राण किया जा सकता है ताकि केवल ऑर्गेनोइड की गोली बनी रहे।
इस दृष्टिकोण की सीमा यह है कि hiPSC-व्युत्पन्न सेल प्रकार अक्सर जीन अभिव्यक्ति और कार्यात्मक प्रोफाइल के संदर्भ में पूरी तरह से परिपक्व नहीं होते हैं। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या hiPSC-व्युत्पन्न आंतों के ऊतक विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है, ऑर्गेनोइड को एंटरोसाइट्स (VIL), एंटरोएंडोक्राइन कोशिकाओं (न्यूरोग 3), गॉब्लेट कोशिकाओं (MUC2), क्षणिक प्रवर्धक कोशिकाओं (CD133), पैनथ कोशिकाओं (FZD5) और LGR5+ स्टेम सेल (LGR5) सहित विभिन्न सेल प्रकारों के लिए विशेषता होनी चाहिए।
कुल मिलाकर, कई अन्य organoid भेदभाव प्रोटोकॉल पर इस प्रोटोकॉल का प्रमुख लाभ यह है कि इस संस्कृति मंच कई पुनः संयोजक प्रोटीन और छोटे अणुओं15,16 के साथ वातानुकूलित मीडिया तैयारी के प्रतिस्थापन के कारण बहुत लागत प्रभावी है. एचजी में भेदभाव बहुत सरल और तेज है और समान परिणामों के साथ मानव भ्रूण और प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं दोनों पर लागू किया जा सकता है। जब सख्ती से पीछा किया, और सेल लाइनों का इस्तेमाल किया जा रहा है के लिए अनुकूलित यह एक अपेक्षाकृत सरल मॉडल मंच दूषित मेसेनकाइमल कोशिकाओं है कि तब सूजन, मेजबान रोगज़नक़बातचीत 7 सहित संदर्भ की एक किस्म में आंतों के उपकला का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है से मुक्त प्रदान करता है. आंतों फाइब्रोसिस मॉडलिंग प्रो-फाइब्रोटिक उत्तेजनाओं प्रदान करके और फिर क्यूपीसीआर, पश्चिमी धब्बा और एलिसा द्वारा कोलेजन, लेमिनिन और फाइब्रोनेक्टिन जैसे बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन की अभिव्यक्ति का आकलन करके जांच की जा सकती है। भेदभाव से पहले उदासीन स्टेम सेल लाइनों पर सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 जीन संपादन तकनीकों का उपयोग जीन नॉकआउट या प्रोटीन ओवरएक्सप्रेशन ऑर्गेनोइड के निर्माण की अनुमति देता है जिसका उपयोग रोग विशिष्ट ऑर्गेनोइड और अधिक जटिल रोग मॉडल 14,17,18 बनाने के लिए किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
NH को MRC (MR/S009930/1) और वेलकम ट्रस्ट (204267/Z/16/Z) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है, PD को MRC PhD DTP द्वारा वित्त पोषित किया जाता है, KLF को BBSRC iCASE द्वारा वित्त पोषित किया जाता है।
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Activin A | R&D | 338-AC | |
Advanced DMEM/F12 (1X) | Life Technologies | 12654-010 | |
B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
CHIR99021 | Sigma | SML1046-5MG | |
Epidermal Growth Factor | R&D Systems | 236-EG-01M | |
Gastrin | Sigma Aldrich | G9145 | |
GlutaMAX (100X) | Life Technologies | 15630-056 | |
Growth Factor reduced Matrigel | BD | ||
HEPES Buffer solution (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
N2 Supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
N-acetyl-cysteine | Sigma Aldrich | A7250 | |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
Noggin | R&D Systems | 6057-NG | |
Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
Paraformaldehyde | VWR | 9713.5 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
Retinoic Acid | Sigma | 302-79-4 | |
ROCK inhibitor | Tocris | 1254/1 | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
RPMI | Sigma | R8758-500ml | |
R-Spondin-1 | Peprotech | 120-38 | |
SB202190 | Tocris | 1264 | |
TrypLe Express | Gibco | 12604-021 | |
Wnt 3a | R&D | 5036-WN |