Questo protocollo consente la differenziazione delle cellule pluripotenti umane in organoidi intestinali. Il protocollo imita il normale sviluppo umano differenziando le cellule in una popolazione di endoderma definitivo, endoderma dell’intestino posteriore e quindi epitelio intestinale. Ciò rende il protocollo adatto sia per lo studio dello sviluppo intestinale che per le applicazioni di modellizzazione delle malattie.
Gli organoidi intestinali derivati da hiPSC sono strutture epiteliali che si auto-assemblano da cellule differenziate in strutture 3D complesse, rappresentative dell’epitelio intestinale umano, in cui presentano strutture simili a cripte/villi. Qui, descriviamo la generazione di organoidi intestinali derivati da hiPSC mediante la differenziazione graduale di hiPSC nell’endoderma definitivo, che viene poi posteriorizzato per formare l’epitelio dell’intestino posteriore prima di essere trasferito in condizioni di coltura 3D. L’ambiente di coltura 3D è costituito da matrice extracellulare (ECM) (ad esempio, Matrigel o altra ECM compatibile) integrata con SB202190, A83-01, Gastrin, Noggin, EGF, R-spondina-1 e CHIR99021. Gli organoidi subiscono un passaggio ogni 7 giorni, durante il quale vengono interrotti meccanicamente prima di essere trasferiti alla matrice extracellulare fresca e lasciati espandere. La QPCR e l’immunocitochimica confermano che gli organoidi intestinali derivati da hiPSC contengono tipi di cellule epiteliali intestinali mature, tra cui cellule caliciformi, cellule di Paneth ed enterociti. Inoltre, gli organoidi mostrano evidenza di polarizzazione per espressione di villina localizzata sulla superficie apicale delle cellule epiteliali.
Gli organoidi risultanti possono essere utilizzati per modellare lo sviluppo intestinale umano e numerose malattie intestinali umane, tra cui le malattie infiammatorie intestinali. Per modellare l’infiammazione intestinale, gli organoidi possono essere esposti a mediatori infiammatori come TNF-α, TGF-β e LPS batterico. Gli organoidi esposti a citochine proinfiammatorie mostrano un fenotipo infiammatorio e fibrotico in risposta. L’accoppiamento di cellule sane rispetto a hiPSC derivate da pazienti con IBD può essere utile per comprendere i meccanismi che guidano l’IBD. Ciò potrebbe rivelare nuovi bersagli terapeutici e nuovi biomarcatori per aiutare nella diagnosi precoce della malattia.
Le proprietà delle cellule staminali pluripotenti (PSC), come l’auto-rinnovamento e la capacità di differenziarsi con qualsiasi tipo di cellula del corpo umano, le rendono strumenti preziosi nello studio dello sviluppo, della patologia delle malattie e dei test farmacologici1. Le cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) sono particolarmente utili per gli studi di modellizzazione della malattia in quanto possono essere derivate dai pazienti, catturando direttamente il genoma responsabile del fenotipo 2,3 della malattia. Tali hiPSC possono essere differenziate in base al tipo di cellula interessata dal difetto genetico, consentendo un attento esame del meccanismo molecolare della malattia4.
I protocolli di differenziamento per le PSC umane mirano a dirigere il differenziamento delle cellule attraverso le principali fasi di sviluppo attraverso l’attivazione o l’inibizione di specifiche vie di segnalazione che governano l’impegno e la specificazione del lignaggio. Il mantenimento di hiPSC in uno stato pluripotente richiede livelli moderati di segnalazione dell’Activina A (Act-A), mentre un alto dosaggio di Act-A per 3 giorni impegna l’hiPSC a un destino endodermico (DE)definitivo 5,6. Le vie Act-A e Wnt dirigono l’identità antero-posteriore del DE. La segnalazione da parte di Act-A induce marcatori dell’intestino anteriore (FG) come HHEX, HNF4α e GATA4, bloccando l’espressione dei geni dell’intestino posteriore (HG) come CDX2. La segnalazione Wnt induce la posteriorizzazione della DE, che poi adotta un profilo di espressione genica HG 7,8. Una volta stabilita l’identità delle cellule HG, la differenziazione può essere spostata da 2D a 3D e indirizzata verso la formazione di organoidi intestinali.
Gli organoidi intestinali sono tipicamente coltivati in un sistema di coltura basato su matrice extracellulare 3D (ad esempio, Matrigel o altri ECM compatibili)9, composto da laminina, collagene IV ed entactina e arricchito con fattori di crescita come EGF, FGF, PDGF e IGF-1 per contribuire alla sopravvivenza e alla proliferazione del supporto. Gli organoidi vengono coltivati in un terreno definito contenente Gastrina, Noggin e CHIR per stimolare e sostenere la crescita e la proliferazione delle cellule staminali intestinali durante la coltura a lungo termine.
Dopo che le cellule epiteliali intestinali sono state incorporate nella matrice extracellulare, le cripte intestinali iniziano a formarsi ed espandersi formando infine sferoidi. Questi maturano in strutture organoidi che imitano il funzionamento fisiologico dell’epitelio intestinale. Gli organoidi possono in genere essere coltivati per più di 1 anno senza una perdita significativa dei profili funzionali e di espressione genica. Il passaggio è richiesto su base settimanale utilizzando la digestione enzimatica degli organoidi in frammenti più piccoli che poi si auto-riassemblano in organoidi completi.
Le linee di organoidi consolidate possono essere utilizzate come modello affidabile di numerosi disturbi legati all’intestino, tra cui il morbo di Crohn, la colite ulcerosa e i tumori del colon-retto 10,11,12,13. Questo è un modello preferito alle cellule animali in quanto esprimono geni umani legati a questi disturbi e rispondono a stimoli esterni più simili a quelli che si verificano nei tessuti umani in vivo.
Qui descriviamo un protocollo per la differenziazione di cellule pluripotenti umane in organoidi intestinali umani. Dimostriamo il loro utilizzo per studiare l’infiammazione; tuttavia, questo può essere applicato a vari contesti, e accoppiato con approcci di editing genetico CRISPR/Cas914, su qualsiasi background genetico. Una volta differenziati, seguendo la naturale sequenza di differenziazione evolutiva dell’endoderma definitivo, dell’endoderma dell’intestino posteriore e quindi dell’epitelio intestinale, gli organoidi risultanti possono essere continuamente coltivati e fatti passare per più di 12 mesi.
Un aspetto critico di questo protocollo è la densità iniziale di placcatura delle cellule staminali indifferenziate prima della differenziazione dell’endoderma. Se questo non è sufficientemente ottimizzato, è probabile che le cellule muoiano durante la fase iniziale di differenziazione DE (se le cellule sono troppo scarse) o riducano l’efficienza della differenziazione DE (se le cellule sono troppo dense). La corretta densità iniziale deve essere ottimizzata per la linea cellulare utilizzata e la densità corretta deve generare un monostrato entro la fine di DE D3. La citometria a flusso dovrebbe essere utilizzata per determinare l’efficienza della specifica DE e in genere vediamo il >80% delle cellule positive per SOX17 e/o CXCR4. Quando il numero di cellule SOX17 positive è inferiore al 60%, l’efficienza del patterning HG è influenzata, il che si traduce nella formazione di un minor numero di organoidi quando viene trasferito alla matrice extracellulare. Ciò alla fine causerà il fallimento delle colture di organoidi risultanti. Per determinare se il patterning da DE a HG ha avuto successo, valutiamo il numero di cellule CDX2 positive mediante citometria a flusso e in genere ci aspettiamo di vedere il >80% di cellule positive. Anche in questo caso, se il numero di cellule CDX2 positive scende al di sotto del 50%, ciò avrà un effetto negativo sul numero di organoidi intestinali che vengono generati quando vengono trasferiti alla coltura di matrice extracellulare 3D.
Dopo il trasferimento di monostrati 2D in coltura 3D, 24-48 ore dopo il trasferimento dovrebbero apparire piccole sfere compatte. Possono comparire grandi fogli di cellule morte a seconda dell’efficienza di differenziazione per la linea cellulare utilizzata. Invece di passare immediatamente le colture per rimuovere questi detriti, permettiamo agli organoidi di formarsi completamente e sviluppare la loro struttura più complessa e piegata. Aspettare 7-10 giorni prima di tentare il primo passaggio assicura che siano presenti cellule in divisione sufficienti per generare molti nuovi organoidi intestinali. Eventuali detriti ancora presenti nella coltura possono essere facilmente rimossi durante il processo di passaggio facendo ruotare lentamente le miscele di organoidi/detriti dissociati in una provetta con una velocità sufficiente per pellettare gli organoidi ma lasciare fogli di cellule che galleggiano nel terreno. I terreni e i detriti cellulari possono quindi essere aspirati in modo che rimanga solo il pellet degli organoidi.
Il limite di questo approccio è che i tipi di cellule derivate da hiPSC spesso non sono completamente maturi in termini di espressione genica e profili funzionali. Per determinare se il tessuto intestinale derivato da hiPSC è adatto per applicazioni specifiche, gli organoidi devono essere caratterizzati per diversi tipi di cellule, tra cui enterociti (VIL), cellule enteroendocrine (neurog3), cellule caliciformi (MUC2), cellule di amplificazione transitoria (CD133), cellule di paneth (FZD5) e cellule staminali LGR5+ (LGR5) per determinare la composizione cellulare dell’organoide.
Nel complesso, il principale vantaggio di questo protocollo rispetto a molti altri protocolli di differenziazione degli organoidi è che questa piattaforma di coltura è molto conveniente grazie alla sostituzione di diverse proteine ricombinanti e preparazioni di terreni condizionati con piccole molecole 15,16. Il differenziamento in HG è molto semplice e veloce e può essere applicato sia a cellule staminali embrionali umane che a cellule staminali pluripotenti indotte con risultati identici. Se seguito rigorosamente e ottimizzato per le linee cellulari utilizzate, fornisce una piattaforma modello relativamente semplice, priva di cellule mesenchimali contaminanti, che può quindi essere applicata per studiare l’epitelio intestinale in una varietà di contesti, tra cui l’infiammazione e le interazioni ospite-patogeno7. La modellazione della fibrosi intestinale potrebbe essere studiata fornendo stimoli pro-fibrotici e quindi valutando l’espressione di proteine della matrice extracellulare come collagene, laminina e fibronectina mediante QPCR, western blot ed ELISA. L’utilizzo di tecniche di editing genetico CRISPR/Cas9 su linee di cellule staminali indifferenziate prima del differenziamento consente la creazione di organoidi di knockout genico o di sovraespressione proteica che potrebbero essere utilizzati per creare organoidi specifici per la malattia e modelli di malattia più complessi 14,17,18.
The authors have nothing to disclose.
NH è finanziato dall’MRC (MR/S009930/1) e dal Wellcome Trust (204267/Z/16/Z), PD è finanziato dall’MRC PhD DTP, KLF è finanziato dal BBSRC iCASE.
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Activin A | R&D | 338-AC | |
Advanced DMEM/F12 (1X) | Life Technologies | 12654-010 | |
B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
CHIR99021 | Sigma | SML1046-5MG | |
Epidermal Growth Factor | R&D Systems | 236-EG-01M | |
Gastrin | Sigma Aldrich | G9145 | |
GlutaMAX (100X) | Life Technologies | 15630-056 | |
Growth Factor reduced Matrigel | BD | ||
HEPES Buffer solution (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
N2 Supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
N-acetyl-cysteine | Sigma Aldrich | A7250 | |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
Noggin | R&D Systems | 6057-NG | |
Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
Paraformaldehyde | VWR | 9713.5 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
Retinoic Acid | Sigma | 302-79-4 | |
ROCK inhibitor | Tocris | 1254/1 | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
RPMI | Sigma | R8758-500ml | |
R-Spondin-1 | Peprotech | 120-38 | |
SB202190 | Tocris | 1264 | |
TrypLe Express | Gibco | 12604-021 | |
Wnt 3a | R&D | 5036-WN |