התקנה בקנה מידה קטן לבדיקת רעילות אצות של ננו חומרים וחומרים קשים אחרים
Summary
אנו מדגימים בדיקות רעילות אצות לחומרים קשים (למשל, חומרים צבעוניים או ננו חומרים) באמצעות התקנה מוארת אנכית עם LED.
Abstract
נתוני Ecotoxicity הם דרישה לרישום לפני ופוסט-שוק של כימיקלים על ידי תקנות אירופאיות ובינלאומיות (למשל, REACH). בדיקת רעילות אצות משמשת לעתים קרובות בהערכת סיכון רגולטורי של כימיקלים. על מנת להשיג אמינות גבוהה ושחזור הפיתוח של קווים מנחים מתוקנים הוא חיוני. לבדיקת רעילות אצות, הקווים המנחים דורשים תנאים יציבים ואחידים של פרמטרים כגון pH, טמפרטורה, רמות פחמן דו חמצני ועוצמת אור. ננו-חומרים וחומרים קשים אחרים לכאורה יכולים להפריע לאור ולגרום לשינוי גדול בתוצאות שהושגו הפוגעות בקבלה הרגולטורית שלהם. כדי להתמודד עם אתגרים אלה, פיתחנו LEVITATT (LED אנכי תאורה טבלה עבור בדיקות רעילות אצות). ההתקנה משתמשת בתאורת LED מלמטה ומאפשרת התפלגות אור הומוגני ובקרה בטמפרטורה, תוך מזעור הצללה תוך-מדגם. ההתקנה ממטבת את נפח הדגימה לכמת ביומסה ומבטיחה בו זמנית זרימה מספקת של CO2 כדי לתמוך בצמיחה אקספוננציאלית של אצות. בנוסף, ניתן להתאים את החומר של מיכלי הבדיקה כדי למזער את ההסחתה וההתבוללות. בעת בדיקת חומרים צבעוניים או מתלי חלקיקים, השימוש בנורות LED מאפשר גם להגדיל את עוצמת האור ללא ייצור חום נוסף. העיצוב הקומפקטי ודרישות הציוד המינימליות מגדילים את האפשרויות ליישום ה-LEVITATT במגוון רחב של מעבדות. בעוד תואם עם הנחיות ISO ו-OECD מתוקננת לבדיקת רעילות אצות, LEVITATT גם הראה שונות בין-מדגם נמוך יותר עבור שני חומרים הפניה (3,5-Dicholorophenol ו K2Cr2O7) ושלושהננו חומרים (ZnO, CeO2,ו BaSO4)בהשוואה למבחנות Erlenmeyer וצלחת microtiter.
Introduction
בדיקת הרעילות של אצות היא אחת משלוש בדיקות חובה בלבד המשמשות ליצירת נתוני רעילות אקולוגית הנדרשים לרישום לפני ופוסט-שוק של כימיקלים על ידי תקנות אירופאיות ובינלאומיות (למשל, REACH1 ו-TSCA (ארה”ב).). לשם כך פותחו הנחיות למבחן אצות מתוקנות על ידי ארגונים בינלאומיים (למשל, ISO ו-OECD). תקני בדיקה וקווים מנחים אלה רושמים תנאי בדיקה אידיאליים במונחים של pH, טמפרטורה, רמות פחמן דו חמצני ועוצמת אור. עם זאת, שמירה על תנאי בדיקה יציבים במהלך בדיקות אצות היא למעשה קשה והתוצאות סובלות מבעיות עם רבייה ואמינות עבור מגוון של חומרים כימיים וננו חומרים (המכונה לעתים קרובות “חומרים קשים”)2. רוב התקנות הקיימות לבדיקת רעילות אצות פועלות בכמויות גדולות יחסית (100-250 מ”ל) הממוקמות על שייקר מסלולי בתוך אינקובטור. הגדרה כזו מגבילה את מספר ריכוזי הבדיקה ומשכפלת כמויות ברות השגה וגביות של תרבות אצות וחומר בדיקה. בנוסף, הגדרות אלה לעתים נדירות יש שדה אור אחיד תנאי תאורה אמינים קשה יותר להשיג במבחנות גדולות, בין השאר כמו עוצמת האור פוחתת אקספוננציאלית ככל שהאור נע ובחלקו בשל גיאומטריית הבקבוקון. הגדרות חלופיות כוללות מיקרוטיטרפלסטיק 3 צלחות המכילות נפחי מדגם קטנים שלא מאפשרים נפחי דגימה נאותים כדי למדוד pH, מדידות ביומסה נוספות, חילוץ פיגמנטים או ניתוחים אחרים הדורשים דגימה הרסנית. אחד האתגרים המסוימים באמצעות הגדרות קיימות לבדיקת רעילות אצות של ננו חומרים וחומרים יוצרים השעיות צבעוניות הוא הפרעה או חסימה של האור הזמין לתאי אצות, המכונה לעתים קרובות“הצללה” 4,,5. הצללה עלולה להתרחש בתוך בקבוקונים על ידי חומר הבדיקה ו/או אינטראקציות בין חומר הבדיקה לבין תאי הצלחות, או הצללה יכולה להתרחש בין בקבוקונים, בשל מיקומם ביחס זה לזה ומקור האור.
השיטה מבוססת על התקנה של בדיקת רעילות אצות בקנה מידה קטן שהציגה ארנסברג ואח’6, המאפשרת בדיקה בהתאם לתקנים כגון OECD 2017 ו-ISO 869278. השיטה ממוטבת עוד יותר כדי לטפל במגבלות שצוינו לעיל על ידי: 1) ניצול טכנולוגיית תאורת LED כדי להבטיח תנאי תאורה אחידים עם ייצור חום מינימלי, 2) מתן נפח מדגם הולם לניתוח כימי/ביולוגי תוך שמירה על רמת pH קבועה, CO2 ו-3) המאפשר שימוש בחומר מיכל בדיקה רב-תכליתי לבדיקת חומרים או חומרים נדיפים בעלי פוטנציאל פתרון גבוה.
Protocol
Representative Results
Discussion
Phytoplankton ממירה אנרגיה סולארית ופחמן דו חמצני חומר אורגני ובכך מחזיק תפקיד מרכזי במערכת האקולוגית הימית. מסיבה זו, בדיקות עיכוב קצב הצמיחה אצות כלולים כאחד משלוש בדיקות רעילות ימית חובה הנדרשים להערכת סיכון רגולטורי של כימיקלים. היכולת לבצע בדיקת רעילות אצות אמינה ותורגלית היא המפתח בהקשר …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי PATROLS – כלים מתקדמים לבדיקת NanoSafety, הסכם מענק 760813 במסגרת תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020.
Materials
| Acetone | Sigma-Aldrich | V179124 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134 | |
| BlueCap bottles (1L) | Buch & Holm A/S | 9072335 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B0394 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 208290 | |
| Clear acrylic sheet (40×40 cm) | |||
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Copper(II) chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 307483 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluorescence Spectrophotometer F-7000 | Hitachi | ||
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| LED light source | Helmholt Elektronik A/S | H35161 | Neutral White, 6500K |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Orbital shaker | IKA | 2980200 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Raphidocelis subcapitata | NORCCA | NIVA-CHL1 strain | |
| Scintillation vials (20 mL) | Fisherscientific | 11526325 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Spring clamp | Frederiksen Scientific A/S | 472002 | |
| Thermostatic cabinet | VWR | WTWA208450 | Alternative: temperature controlled room |
| Ventilation pipe (Ø125 mm) | Silvan | 22605630165 | |
| Volumetric flasks (25 mL) | DWK Life Sciences | 246781455 | |
| Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
- European Chemicals Agency. Guidance on Registration. European Chemicals Agency. , (2016).
- Organisation for Economic Cooperation and Development. Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2019).
- Blaise, C., Legault, R., Bermingham, N., Van Coillie, R., Vasseur, P. A simple microplate algal assay technique for aquatic toxicity assessment. Toxicity Assessment. 1 (3), 261-281 (1986).
- Hjorth, R., Sorensen, S. N., Olsson, M. E., Baun, A., Hartmann, N. B. A certain shade of green: can algal pigments reveal shading effects of nanoparticles. Integrated Environmental Assessment and Management. 12 (1), 200-202 (2016).
- Chen, F., et al. Algae response to engineered nanoparticles: current understanding{,} mechanisms and implications. Environmental Science: Nano. 6 (4), 1026-1042 (2019).
- Arensberg, P., Hemmingsen, V. H., Nyholm, N. A miniscale algal toxicity test. Chemosphere. 30 (11), 2103-2115 (1995).
- Organisation for Economic Cooperation and Development. Test No. 201: Freshwater Alga and Cyanobacteria, Growth Inhibition Test. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2011).
- International Organization for Standardization (ISO). Water Quality – Fresh Water Algal Growth Inhibition Test with Unicellular Green Algae. International Organization for Standardization (ISO). , (2012).
- Halling-Sørensen, B., Nyhohn, N., Baun, A. Algal toxicity tests with volatile and hazardous compounds in air-tight test flasks with CO2 enriched headspace. Chemosphere. 32 (8), 1513-1526 (1996).
- Mayer, P., Nyholm, N., Verbruggen, E. M. J., Hermens, J. L. M., Tolls, J. Algal growth inhibition test in filled, closed bottles for volatile and sorptive materials. Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (10), 2551-2556 (2000).
- Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PloS One. 10 (12), 0146021 (2015).
- Birch, H., Kramer, N. I., Mayer, P. Time-resolved freely dissolved concentrations of semivolatile and hydrophobic test chemicals in in vitro assays-measuring high losses and crossover by headspace solid-phase microextraction. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1780-1790 (2019).
- Trac, L. N., Schmidt, S. N., Mayer, P. Headspace passive dosing of volatile hydrophobic chemicals – toxicity testing exactly at the saturation level. Chemosphere. 211, 694-700 (2018).
- Eisentraeger, A., Dott, W., Klein, J., Hahn, S. Comparative studies on algal toxicity testing using fluorometric microplate and Erlenmeyer flask growth-inhibition assays. Ecotoxicology and Environmental Safety. 54 (3), 346-354 (2003).
- Paixao, S. M., Silva, L., Fernandes, A., O’Rourke, K., Mendonca, E., Picado, A. Performance of a miniaturized algal bioassay in phytotoxicity screening. Ecotoxicology. 17 (3), 165-171 (2008).
- Thellen, C., Blaise, C., Roy, Y., Hickey, C. Round-robin testing with the selenastrum–capricornutum microplate toxicity assay. Hydrobiologia. 188, 259-268 (1989).
- Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicology and Environmental Safety. 94, 37-44 (2013).
- Lee, W. M., An, Y. J. Effects of zinc oxide and titanium dioxide nanoparticles on green algae under visible, UVA, and UVB irradiations: no evidence of enhanced algal toxicity under UV pre-irradiation. Chemosphere. 91 (4), 536-544 (2013).
- Samei, M., Sarrafzadeh, M. H., Faramarzi, M. A. The impact of morphology and size of zinc oxide nanoparticles on its toxicity to the freshwater microalga, Raphidocelis subcapitata. Environmental Science and Pollution Research. 26 (3), 2409-2420 (2019).
- Neale, P. A., Jaemting, A. K., O’Malley, E., Herrmann, J., Escher, B. I. Behaviour of titanium dioxide and zinc oxide nanoparticles in the presence of wastewater-derived organic matter and implications for algal toxicity. Environmental Science: Nano. 2 (1), 86-93 (2015).
- Hartmann, N. B., et al. The challenges of testing metal and metal oxide nanoparticles in algal bioassays: titanium dioxide and gold nanoparticles as case studies. Nanotoxicology. 7 (6), 1082-1094 (2013).
- Farkas, J., Booth, A. M. Are fluorescence-based chlorophyll quantification methods suitable for algae toxicity assessment of carbon nanomaterials. Nanotoxicology. 11 (4), 569-577 (2017).
- Handy, R. D., et al. Practical considerations for conducting ecotoxicity test methods with manufactured nanomaterials: what have we learnt so far. Ecotoxicology. 21 (4), 933-972 (2012).
- Handy, R. D., et al. Ecotoxicity test methods for engineered nanomaterials: practical experiences and recommendations from the bench. Environmental Toxicology and Chemistry. 31 (1), 15-31 (2012).
