En metode er beskrevet for samtidig isolering af myocytter og ikke-myocytter fra både atrierne og hjertekamrene i en enkelt voksen mus hjerte. Denne protokol resulterer i ensartede udbytter af meget levedygtige hjerte myocytter og ikke-myocytter og detaljer optimal celle-specifikke kultur betingelser for fænotyping og in vitro analyse.
Isolation og dyrkning af hjerte myocytter fra mus har været afgørende for at fremme forståelsen af hjertefysiologi og patofysiologi. Mens isolere myocytter fra neonatal mus hjerter er relativt ligetil, myocytter fra den voksne murine hjerte foretrækkes. Dette skyldes, at sammenlignet med neonatale celler, voksne myocytter mere præcist opsummere cellefunktion, som det forekommer i det voksne hjerte in vivo. Det er dog teknisk vanskeligt at isolere hjertemyocytter til voksne mus i de nødvendige mængder og levedygtighed, hvilket bidrager til et eksperimentelt dødvande. Desuden er offentliggjorte procedurer specifikke for isolering af enten atrie- eller ventrikulære myocytter på bekostning af atrie- og ventrikulære ikke-myocytceller. Beskrevet her er en detaljeret metode til at isolere både atrie og ventrikulær hjerte myocytter, sammen med atrie og ventrikulær ikke-myocytter, samtidig fra en enkelt mus hjerte. Der er også oplysninger om optimale cellespecifikke dyrkningsmetoder, som forbedrer cellegabiliteten og -funktionen. Denne protokol har ikke kun til formål at fremskynde processen med voksen murine hjertecelleisolering, men også at øge udbyttet og levedygtigheden af celler til undersøgelser af atrie- og ventrikulære hjerteceller.
Primær cellekultur er en integreret ressource, der tilbyder et kontrolleret miljø til detaljerede mekanistiske undersøgelser af hjerte myocytfunktion. På grund af deres mere holdbare natur og lethed af isolation, neonatal rotte atrie og ventrikulær myocytter har været den almindelige kilde til sådanne cellekulturer1. Men voksne mus atrie og ventrikulær myocytter (AMAMs og AMVMs) er meget ønskeligt for in vitro undersøgelser, fordi deres molekylære og funktionelle egenskaber bedre efterligne dem af voksne hjerteceller. Således er de blevet relevante for undersøgelser relateret til hjertepatologier, hvoraf de fleste udvikler sig hos voksne2.
Desuden, tilgængeligheden og brugen af transgene og sygdom mus modeller udvider nytten af isolerede voksne hjerte myocytter. Protokoller for isolation og kultur af mus AMVMs for kort- og langsigtede undersøgelser er blevet beskrevet i talrige tidligere publikationer2,3 ,4,5,6,7,8,9,10,11. Til sammenligning er der kun beskrevet få protokoller for isolering af AMAM’er. Desuden er de beskrevne primært optimeret til akutte undersøgelser af frisk isolerede celler uden nogen langsigtet dyrkningsprotokol beskrevet til dato11,12,13. Som sådan var AMAM-isolationsprotokoller ikke designet til at give nytten og alsidigheden af offentliggjorte protokoller til isolering og kultur af AMVM’er. Selv om de banebrydende undersøgelser for isolering af AMAM’er og AMVM’er har vist sig at være ressourcestærke, er der ingen protokoller for optimal samtidig isolation og kultur af både AMAMs og AMVMs, hvilket resulterer i effektiv udnyttelse af hele hjertet til hvert præparat.
Indtil nu har offentliggjorte AMAM- og AMVM-isolationsprotokoller ikke været designet til samtidig isolering af begge celletyper, fordi de fleste undersøgelser af atrie- og ventrikulær funktion har et kammerspecifikt fokus. For eksempel bruges AMAMs overvejende til at studere atrie myocyt elektrofysiologi, dels på grund af interessen for atrieflimren (AF), den mest almindelige hjertearytmi i USA. Af er dog ikke en sygdom, der påvirker atrierne isoleret, og det har været impliceret som havende en årsagsrolle i mild til svær venstre ventrikel dysfunktion14. Desuden har elektrokardiogrammer fra patienter med hjertesvigt med bevaret udslyngningsfraktion (HFpEF) illustreret, at venstre atriestørrelse er en af de stærkeste prædiktorer for modtagelighed for hjertesvigt15.
Ud over sin rolle i elektrofysiologi og kontraktilitet er atriet også et endokrine organ, der udskiller kardiokiner (dvs. atrie natriuretisk peptid [ANP]), der homeostatisk regulerer blodtryk og volumen16,17. Desuden ANP (formentlig fra atrie myocytter) har en fremtrædende beskyttende og anti-hypertrofisk rolle i ventrikulær myocytter16,17. Mens der er en stærk implikation af neurohormonal kommunikation mellem atria og hjertekamre i forskellige sygdomstilstande, er de mekanismer, der ligger til grund for denne kommunikation, ikke blevet undersøgt fuldt ud. Dette punkt er yderligere eksemplificeret ved den kraftige stigning i forskning med fokus på 1) den rolle, som ikke-myocytter (specifikt hjerte fibroblaster og immunceller) i syge hjerte og 2) hvordan hjerte remodeling som en funktion af sygdommen direkte påvirker hjerte myocyt levedygtighed og globale hjertefunktion18,19,20,21,22. Således er det at studere hjerteceller fra både atria og ventrikler en nødvendig tilgang for at få et mere komplet billede af deres roller i hjertepatofysiologi.
Følgende protokol beskriver den samtidige isolering af atrie og ventrikulære myocytter og ikke-myocytter fra et enkelt musehjerte under fysiologiske og patofysiologiske forhold. Derudover er denne metode den første til at beskrive optimale betingelser, der er nødvendige for at opretholde kulturer af atrie hjerte myocytter, da betingelserne for at opretholde kulturer af ventrikulære myocytter allerede er blevet offentliggjort.
Kvaliteten af cellerne isoleret ved hjælp af den procedure, der er beskrevet her, som bestemt af celleudbyttet og den generelle sundhed af cellerne i kulturen, afhænger af mange kontrollerbare faktorer. Begyndende med musen selv er det dokumenteret, at stress, der pålægges dyret, kan påvirke celleudbyttet og levedygtigheden i kulturen negativt, formentlig på grund af overskydende systemisk kortisol, katekolaminer og hjertevævets hyperkontraktiske tilstand2,5,7. Af disse grunde bør der træffes foranstaltninger for at undgå at alarmere dyret inden ofringen. Sådanne foranstaltninger omfatter dækning af dyrets bur og begrænsning af tid uden for vivarium før ofring. Heparin og mange barbiturater, der almindeligvis anvendes til aktiv dødshjælp, kan påvirke signalvejene; Derfor bør den optimale metode til aktiv dødshjælp tilpasses i overensstemmelse hermed. Dyrets alder har en betydelig indvirkning på kvaliteten og levedygtigheden af isolerede celler, sandsynligvis på grund af progressiv akkumulering af interstitiel fibrose, der forekommer samtidig med aldringsprocessen, hvilket kan påvirke vævsfordøjelsen25. I data, der ikke præsenteres her, mens den ovenfor beskrevne metode virker hos mus på op til 78 uger gamle, var cellernes kvalitet lavere hos disse ældre dyr.
Det mest kritiske skridt i den beskrevne isolationsproces samt andre protokoller med et Langendorff-apparat til retrograd perfusion er cannulationen og den første perfusion af hjertet. For at opnå optimale resultater bør tiden fra hjerteudrulning til cannulation af den opstigende aorta og påbegyndelse af perfusion ikke tage mere end 90 s. Ud over tid er to yderligere vigtige faktorer dybden af kanylen og muligheden for at indføre luft emboli fra perfusionsapparatet. Derfor bør kanylen rykkes ind i den opstigende aorta for ikke at komme ind i aortaroden og blokere aortaklappen, hvilket ville forringe perfusionen af kransekarrene.
Under fordøjelsesprocessen er det vigtigt regelmæssigt at teste hjertets stivhed for at undgå langvarig eksponering for fordøjelsesenzymet collagenase, hvilket reducerer hjerte myocyt calciumtolerance. Protokollen er beskrevet ovenfor for calcium genindførelse i den isolerede ventrikulær myocyt kulturer var designet til at begrænse hjerte myocyt død via uhensigtsmæssig calcium tilstrømning via butik drives calcium kanaler. Det skal bemærkes, at den trinvise calcium genindførelse ikke bør udføres for isolerede atrie myocytkulturer, da dette vil fremme celledød under kort- og langsigtet kultur12. For yderligere forsigtighed, perfusion og fordøjelse buffere, der anvendes her omfatter hjertemusklen sammentrækning hæmmer butanedione monoxime (BDM) for at undgå hyperkonference af isolerede myocytter, samt calcium paradoks, som begge påvirker myocyt levedygtighed26. Men skiftet fra BDM til blebbistatin skal bemærkes, da det er den foretrukne anti-kontraktile agent i at opretholde medier for isolerede hjerte myocytter. I data, der ikke er vist, giver blebbistatin større levedygtighed for langsigtet kultur af isolerede hjerte myocytter.
Umiddelbart efter isolation er det vigtigt at overveje konsekvenserne af langvarig kultur af hjerteceller, især myocytter. Den hjerte ikke-myocyt isolation og dyrkning protokol, der er beskrevet her, er baseret på fælles metoder, der drager fordel af de forskellige tætheder og klæbende egenskaber af forskellige hjerteceller. Fordelen ved ikke-myocytter er deres høje ekspansionspotentiale i kulturen; således, i modsætning til hjerte myocytter, de er modtagelige for passaging for fastholdelse. Det er dog kendt, at dyrkningsbetingelser, herunder medium tilskud med FBS, kan påvirke hjerte myocytfunktionalitet27. De kulturmedier, der er beskrevet her, var designet til at optimere levedygtigheden og begrænse funktionelle sindsforvirring, især for de isolerede atrie myocytter. Mens ingen åbenlys nedsat kontraktil evne blev observeret i isolerede hjerte myocytter efter kultur i mangel af blebbistatin tilskud, undersøgelser, der fokuserer på elektrofysiologi, kontraktilitet, og andre enkelt-celle in vivo-baserede molekylære signalering bør udføres kort efter isolation, når den sarkomeriske struktur og molekylære signatur stadig efterligner den intakte hjerte.
Et kendetegn ved atrie myocyt er dens evne til at måneskin som en endokrine celle med enorm sekretorisk kapacitet, ud over deres kontraktile funktion. Under fysiologiske forhold producerer atrie myocytter store mængder ANP, som opbevares i det endoplasmiske reticulum og i store tætte kerne sekretoriske granulater klar til reguleret exocytose ved modtagelse af en stimulus16,17. Mens mange isolerede atrie myocyt undersøgelser fokuserer på deres unikke elektrofysiologiske egenskaber, dette er den første undersøgelse til at designe en kultur medier. Dette giver mulighed for langsigtet levedygtighed samt fremme af de vedligeholdte funktioner endokrine og kontraktile egenskaber atrie myocytter. Denne nye metode til dyrkning, samt samtidig isolering af alle celletyper fra atrie- og ventrikulære kamre fra et enkelt musehjerte, vil være nyttig og effektiv til undersøgelser af de fysiologiske og patofysiologiske egenskaber hos både atrie- og ventrikulære myocytter.
The authors have nothing to disclose.
E.A.B. blev støttet af National Institutes of Health (1F31HL140850), ARCS Foundation, Inc., San Diego kapitel, og er en Rees-Stealy Research Foundation Phillips Gausewitz, MD Scholar af SDSU Heart Institute. E.A.B. og A.S.B. blev støttet af Inamori Foundation. CCG af (NIH) tilskud R01 HL135893, R01 HL141463 og HL149931.
(-)-Blebbistatin | Sigma-Aldrich | B0560 | |
1 Liter Water Jacketed Reservoir | Radnoti | 120142-1 | |
2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
5-0 Silk Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | |
Adenosine | Sigma-Aldrich | A9251 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A6003 | |
Bubble Trap Compliance Chamber | Radnoti | 130149 | |
Calcium Chloride Anhydrous | Fisher Scientific | C614-500 | |
Carnitine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C9500 | |
Collagenase type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | |
Creatine | Sigma-Aldrich | C0780 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | |
DMEM/F12 (1:1; 1X) | Gibco | 11330-032 | |
Dumont #7 – Fine Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
Epifluorescent micropscpe | Olympus X70 | IX70 | |
Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | Omega Scientific | FB-12 | Lot# 206018 |
Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | |
Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
Headband Magnifiers | Fine Science Tools | 28030-04 | |
Hemacytometer (Bright-Line) | Hausser Scientific | 1475 | |
HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
Inosine | Sigma-Aldrich | I4125 | |
Insulin-Transferrin-Selenium-X | Gibco | 51500-056 | |
Isotemp 105 Water Bath | Fisher Scientific | NC0858659 | |
Isotemp 3006 | Fisher Scientific | 13-874-182 | |
Joklik Modified Minimum Essential Media | Sigma-Aldrich | M-0518 | |
Laminin (Natural, Mouse) | Gibco | 1795024 | Lot# 1735572 |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540 | |
Masterflex C/L Single-Channel Variable-Speed Compact Pump | Cole-Palmer | EW-77122-24 | |
Minimum Essential Medium (MEM 1X) | Gibco | 12350-039 | |
Molecular Biology Grade Water | Corning | 46-000-CM | |
Pen Strep Glutamine (100X) | Gibco | 10378-016 | |
Spring Scissors – 6mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15020-15 | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T-8691 |