En metod beskrivs för samtidig isolering av myocyter och icke-myocyter från både atria och ventriklarna i en enda vuxen mus hjärta. Detta protokoll resulterar i konsekventa utbyten av mycket livskraftiga hjärt myocyter och icke-myocyter och detaljer optimal cell-specifika kultur villkor för fenotypning och in vitro analys.
Isolering och odling av hjärt myocyter från möss har varit avgörande för att främja förståelsen av hjärt fysiologi och patofysiologi. Medan isolera myocyter från neonatal mus hjärtan är relativt enkelt, myocyter från den vuxna murin hjärtat föredras. Detta beror på att jämfört med neonatala celler, vuxna myocyter mer exakt rekapitulera cellfunktionen som det förekommer i det vuxna hjärtat in vivo. Det är dock tekniskt svårt att isolera vuxna mus hjärt myocyter i de nödvändiga mängderna och livskraften, vilket bidrar till ett experimentellt dödläge. Dessutom är offentliggjorda förfaranden specifika för isolering av antingen förmaksflimmer eller ventrikulära myocyter på bekostnad av förmaks- och ventrikulära icke-myocytceller. Beskrivs här är en detaljerad metod för att isolera både förmaksflimmer och Ventrikulärt hjärt myocyter, tillsammans med förmaksflimmer och ventrikulära icke-myocyter, samtidigt från en enda mus hjärtat. Dessutom finns detaljerna för optimala cellspecifika odlingsmetoder, vilket förbättrar cellens livskraft och funktion. Detta protokoll syftar inte bara till att påskynda processen för vuxna murin hjärtcell isolering, men också att öka utbytet och livskraften hos celler för undersökningar av förmaksflimmer och ventrikulära hjärtceller.
Primär cellkultur är en integrerad resurs som erbjuder en kontrollerad miljö för detaljerade mekanistiska studier av hjärt myocyt funktion. På grund av deras mer hållbara natur och enkel isolering har neonatal råtta förmaksflimmer och ventrikulära myocyter varit den gemensamma källan till sådana cellkulturer1. Vuxna mus förmaksflimmer och ventrikulära myocyter (AMAMs och AMVMs) är dock mycket önskvärda för in vitro studier, eftersom deras molekylära och funktionella egenskaper bättre efterliknar vuxna hjärtceller. Således har de blivit relevanta för studier relaterade till hjärtpatologier, varav de flesta utvecklas hos vuxna2.
Dessutom utökar tillgängligheten och användningen av transgena och sjukdomsmusmodeller nyttan av isolerade vuxna hjärt myocyter. Protokoll för isolering och kultur av mus AMVMs för kort- och långtidsstudier har beskrivits i många tidigare publikationer2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. I jämförelse har få protokoll beskrivits för isolering av AMAMs. Dessutom är de som beskrivs främst optimerade för akuta studier av nyisolerade celler, utan något långsiktigt odlingsprotokoll beskrivethittills 11,12,13. Amam-isoleringsprotokollen utformades därför inte för att ge användbarheten och mångsidigheten hos publicerade protokoll för isolering och kultur av amvm-skivor. Även om de banbrytande studierna för isolering av AMAMs och AMVMs har visat sig vara resursstarka, finns det inga protokoll för optimal samtidig isolering och kultur av både AMAMs och AMVMs, vilket resulterar i effektiv användning av hela hjärtat för varje beredning.
Hittills har publicerade AMAM- och AMVM-isoleringsprotokoll inte utformats för samtidig isolering av båda celltyperna, eftersom de flesta studier på förmaks- och ventrikulär funktion har ett kammarspecifikt fokus. Till exempel används AMAMs främst för att studera förmaksmyocytelektrofysiologi, delvis på grund av intresset för förmaksflimmer (AF), den vanligaste hjärtrytmrubbningen i USA. AF är dock inte en sjukdom som påverkar atria i isolering, och det har varit inblandad som att ha en orsakande roll i mild till svår vänster Ventrikulärt dysfunktion14. Dessutom har elektrokardiogram från patienter med hjärtsvikt med bevarad utmatningsfraktion (HFpEF) visat att vänster förmaksstorlek är en av de starkaste prediktorerna för mottaglighet för hjärtsvikt15.
Förutom sin roll i elektrofysiologi och kontraktilitet är atriumet också ett endokrint organ som utsöndrar kardiokiner (dvs. förmaksflimmernatriuretisk peptid [ANP]) som homeostatiskt reglerar blodtrycket ochvolymen 16,17. Dessutom har ANP (förmodligen från förmaksflimmer myocyter) en framträdande skyddande och antihypertrofisk roll i ventrikulära myocyter16,17. Medan det finns en stark implikation av neurohormonal kommunikation mellan atria och ventriklarna i olika sjukdom stater, mekanismerna bakom detta meddelande har inte utforskats fullt ut. Denna punkt exemplifieras ytterligare av ökningen av forskning med fokus på 1) rollen av icke-myocyter (särskilt hjärtfibroblaster och immunceller) i det sjuka hjärtat och 2) hur hjärtombyggnad som en funktion av sjukdom direkt påverkar hjärtmyocyt livskraft och global hjärtfunktion18,19,20,21,22. Att studera hjärtceller från både atria och ventriklar är således ett nödvändigt tillvägagångssätt för att få en mer fullständig bild av deras roller i hjärtpatofysiologi.
Följande protokoll beskriver samtidig isolering av förmaksflimmer och ventrikulära myocyter och icke-myocyter från ett enda mushjärta under fysiologiska och patofysiologiska förhållanden. Dessutom är denna metod den första att beskriva optimala villkor som är nödvändiga för att upprätthålla kulturer av förmaksflimmer hjärt myocyter, som villkor för att upprätthålla kulturer av Ventrikulärt myocyter har redan publicerats.
Kvaliteten på de celler som isoleras med hjälp av det förfarande som beskrivs här, som bestäms av cellutbytet och den övergripande hälsan hos cellerna i kulturen, beror på många kontrollerbara faktorer. Från och med musen själv har det dokumenterats att stress som åläggs djuret kan påverka cellutbytet och livskraften i kulturen negativt, förmodligen på grund av överskott av systemiskt kortisol, katekolaminer och hjärtvävnadens hyperkontraktila tillstånd2,5,7. Av dessa skäl bör åtgärder vidtas för att undvika att skrämma djuret före offer. Sådana åtgärder omfattar att täcka djurets bur och begränsa tiden utanför vivarium före uppoffring. Heparin och många barbiturater som ofta används för dödshjälp kan påverka signalvägar; Den optimala metoden för dödshjälp bör därför anpassas i enlighet med detta. Djurets ålder har en betydande inverkan på kvaliteten och livskraften hos isolerade celler, sannolikt på grund av progressiv ackumulering av interstitiell fibros som förekommer samtidigt med åldrandeprocessen, vilket kan påverka vävnadssammanfattningen25. I data som inte presenteras här, medan metoden som beskrivs ovan fungerar hos möss upp till 78 veckor gamla, var cellernas kvalitet lägre hos dessa äldre djur.
Det mest kritiska steget i isoleringsprocessen som beskrivs, liksom andra protokoll med en Langendorff-apparat för retrograd perfusion, är kannuleringen och den första perfusionen av hjärtat. För optimala resultat bör tiden från hjärt explantation till cannulation av stigande stora kroppsmassa och inledandet av perfusion inte ta mer än 90 s. Förutom tid är två ytterligare viktiga faktorer kanylens djup och möjligheten att införa luftemboli från perfusionsapparaten. Följaktligen bör kanylen föras in i den stigande stora kroppsorten för att inte komma in i aortaroten och hindra aortaventilen, vilket skulle försämra perfusionen av kranskärlen.
Under matsmältningsprocessen är det viktigt att regelbundet testa hjärtats styvhet för att undvika långvarig exponering för matsmältningsenzymet kollagenas, vilket minskar kalciumtoleransen för hjärt myocyt. Protokollet som beskrivs ovan för kalcium återintroduktion i isolerade Ventrikulärt myocyt kulturer utformades för att begränsa hjärt myocyt död via olämpliga kalcium tillströmning via lagra drivs kalcium kanaler. Det bör noteras att stegvis kalcium återintroduktion inte bör utföras för isolerade förmaksflimmer myocyt kulturer, eftersom detta kommer att främja celldöd under kort- och långsiktiga kultur12. För ytterligare försiktighet, perfusion och matsmältning buffertar som används här inkluderar hjärt muskel sammandragning hämmare butanedione monoxime (BDM) för att undvika hypercontraction av isolerade myocyter, liksom kalcium paradoxen, som båda påverkar myocyt livskraft26. Övergången från BDM till blebbistatin bör dock noteras, eftersom det är det föredragna antikontraktila medlet för att upprätthålla media för isolerade hjärt myocyter. I data som inte visas ger blebbistatin större livskraft för långvarig odling av isolerade hjärt myocyter.
Omedelbart efter isolering är det viktigt att överväga konsekvenserna av långvarig kultur av hjärtceller, särskilt myocyter. Hjärt icke-myocyt isolering och odling protokoll beskrivs här är baserat på vanliga metoder som dra nytta av de olika densiteterna och självhäftande egenskaperna hos olika hjärtceller. Fördelen med icke-myocyter är deras höga expansionspotential inom kulturen; Således, till skillnad från hjärtmyocyter, är de mottagliga för att passa för fortlevnad. Emellertid, Det är känt att odling villkor, inklusive medium tillskott med FBS, kan påverka hjärt myocyt funktionalitet27. Kulturmedierna som beskrivs här utformades för att optimera livskraften och begränsa funktionella derangements, särskilt för isolerade förmaksflimmer myocyter. Medan ingen alltför nedsatt kontraktil förmåga observerades i isolerade hjärt myocyter efter kultur i avsaknad av blebbistatin tillskott, studier som fokuserar på elektrofysiologi, contractility och andra encellig in vivo-baserade molekylär signalering bör utföras strax efter isolering, när sarkomisk struktur och molekylär signatur fortfarande efterliknar det intakta hjärtat.
Ett kännetecken för den förmaksmyocyt är dess förmåga att månsken som en endokrin cell med enorm sekretersförmåga, förutom deras kontraktila funktion. Under fysiologiska förhållanden producerar förmaksflimmer myocyter stora mängder ANP, som lagras i det endoplasmatiska retikulumet och i stora täta kärnsekretoriska granulat redo för reglerad exocytos när de får en stimulans16,17. Medan många isolerade förmaksmyocytstudier fokuserar på deras unika elektrofysiologiska egenskaper, är detta den första studien för att designa ett kulturmedier. Detta möjliggör långsiktig livskraft samt främjande av de underhållna funktionerna i endokrina och kontraktila egenskaper hos förmaksmyocyter. Denna nya metod för odling, liksom samtidig isolering av alla celltyper från förmaks- och ventrikulära kammare från ett enda mushjärta, kommer att vara användbar och effektiv för studier av de fysiologiska och patofysiologiska egenskaperna hos både förmaks- och ventrikulära myocyter.
The authors have nothing to disclose.
E.A.B. stöddes av National Institutes of Health (1F31HL140850), ARCS Foundation, Inc., San Diego Chapter, och är en Rees-Stealy Research Foundation Phillips Gausewitz, M.D. Scholar vid SDSU Heart Institute. E.A.B. och A.S.B. stöddes av Inamori Foundation. CCG by (NIH) beviljar R01 HL135893, R01 HL141463 och HL149931.
(-)-Blebbistatin | Sigma-Aldrich | B0560 | |
1 Liter Water Jacketed Reservoir | Radnoti | 120142-1 | |
2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
5-0 Silk Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | |
Adenosine | Sigma-Aldrich | A9251 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A6003 | |
Bubble Trap Compliance Chamber | Radnoti | 130149 | |
Calcium Chloride Anhydrous | Fisher Scientific | C614-500 | |
Carnitine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C9500 | |
Collagenase type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | |
Creatine | Sigma-Aldrich | C0780 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | |
DMEM/F12 (1:1; 1X) | Gibco | 11330-032 | |
Dumont #7 – Fine Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
Epifluorescent micropscpe | Olympus X70 | IX70 | |
Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | Omega Scientific | FB-12 | Lot# 206018 |
Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | |
Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
Headband Magnifiers | Fine Science Tools | 28030-04 | |
Hemacytometer (Bright-Line) | Hausser Scientific | 1475 | |
HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
Inosine | Sigma-Aldrich | I4125 | |
Insulin-Transferrin-Selenium-X | Gibco | 51500-056 | |
Isotemp 105 Water Bath | Fisher Scientific | NC0858659 | |
Isotemp 3006 | Fisher Scientific | 13-874-182 | |
Joklik Modified Minimum Essential Media | Sigma-Aldrich | M-0518 | |
Laminin (Natural, Mouse) | Gibco | 1795024 | Lot# 1735572 |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540 | |
Masterflex C/L Single-Channel Variable-Speed Compact Pump | Cole-Palmer | EW-77122-24 | |
Minimum Essential Medium (MEM 1X) | Gibco | 12350-039 | |
Molecular Biology Grade Water | Corning | 46-000-CM | |
Pen Strep Glutamine (100X) | Gibco | 10378-016 | |
Spring Scissors – 6mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15020-15 | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T-8691 |