Isolatie van vetweefselkern voor eencellige genomische toepassingen
Summary
Deze publicatie beschrijft een protocol voor de isolatie van kernen van volwassen adipocyten, zuivering door fluorescentie-geactiveerde sortering en transcriptie op eencellig niveau.
Abstract
Bruin en beige vet zijn gespecialiseerde vetweefsels die energie voor thermogenese afvoeren door UCP1 (Uncoupling Protein-1)-afhankelijke en onafhankelijke trajecten. Tot voor kort werden thermogene adipocyten beschouwd als een homogene populatie. Recente studies hebben echter aangetoond dat er meerdere subtypen of subpopulaties zijn die verschillend zijn in ontwikkelingsoorsprong, substraatgebruik en transcriptoom. Ondanks de vooruitgang in eencellige genomics, onbevooroordeelde afbraak van vetweefsel in cellulaire subtypes is uitdagend vanwege de fragiele aard van lipide gevulde adipocyten. Het gepresenteerde protocol werd ontwikkeld om deze obstakels te omzeilen door effectieve isolatie van enkele kernen van vetweefsel voor downstreamtoepassingen, waaronder RNA-sequencing. Cellulaire heterogeniteit kan vervolgens worden geanalyseerd door RNA-sequencing en bio-informatica-analyses.
Introduction
Studies hebben aangetoond dat bruin vetweefsel (BBT) een opmerkelijke capaciteit heeft om energie te verdrijven. Er bestaan twee soorten thermogene adipocyten met verschillende ontwikkelingskenmerken bij zowel knaagdieren als mensen: beige adipocyten en klassieke bruine adipocyten. Terwijl klassieke bruine adipocyten zich meestal in intercapulaire BAT-depots bevinden, komen beige adipocyten sporadisch naar voren in wit vetweefsel (WAT) in reactie op bepaalde fysiologische signalen, zoals chronische koude blootstelling, een proces dat wordt aangeduid als “bruinen” of “beiging”. Door het gebruik van geavanceerde beeldvorming is het nu duidelijk dat volwassen mensen aanzienlijke depots van UCP1+ BAT hebben, vooral in supraclaviculaire regio1,2,3,4. De hoeveelheid volwassen menselijke BAT omgekeerd correleert met adipositeit en kan worden verhoogd door externe signalen, zoals chronische blootstelling aan koude5,,6 of β3-adrenerge receptor agonist7. Door baten gemedieerde energie-uitgaven kunnen een levensvatbare aanpak bieden om obesitas te bestrijden.
Tot voor kort werden thermogene adipocyten beschouwd als een homogene populatie. Studies hebben echter het bestaan van meerdere subtypen of subpopulaties aan het licht gebracht die verschillen in ontwikkelingsoorsprong, substraatgebruik en transcriptome8,9,10. Bijvoorbeeld, een soort beige adipocyte die bij voorkeur glucose gebruikt voor thermogenese, de g-beige adipocyte, werd onlangs beschreven10. Het onvolledige begrip van celtypen in bruin en beige vetweefsel en het ontbreken van specifieke markers vormen een kritieke barrière voor het bestuderen van hun biologische functies.
Traditionele methoden voor het isoleren van subpopulaties van cellen zijn gebaseerd op expressie van slechts een paar bekende markergenen. Recente vooruitgang in eencellige genomics maakt het gebruik van wereldwijde genexpressiegegevens van enkele cellen mogelijk om een onbevooroordeelde schatting te geven van het aantal subpopulaties in een weefsel. Het uiteindelijke doel van dit protocol is om alle vetweefsel subtypes te bepalen onder verschillende thermogene stimuli op een eencellige resolutie. In tegenstelling tot andere weefsels en celtypen is het bepalen van cellulaire subtypes van vetweefsel een uitdaging vanwege de kwetsbaarheid van met lipide gevulde adipocyten. Dit papier introduceert een robuust protocol om enkele kernen te isoleren van vetweefsel voor downstream-toepassing op snRNA-sequencing. Belangrijk is dat recente literatuur die goed overeenkomende single-nuclei RNA sequencing (snRNA-seq) en single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) datasets te vergelijken bleek dat snRNA-seq is vergelijkbaar met scRNA-seq in celtype detectie, en superieur in cellulaire dekking voor een complex weefsel als de hersenen11. Dit protocol combineert een dichtheidsgradiëntcentrifugatiemethode geoptimaliseerd voor vetweefsel door Rosen et al.12 met een kern “cleanup” stap met een MoFlo XDP High Speed Sorter. Zoals te zien in de representatieve resultaten, een analyse van 7.500 enkele kernen van de muis interscapulaire bruin vetweefsel geïdentificeerd meerdere celtypes binnen schijnbaar homogene bruine adipocyten. Over het algemeen kan dit eenvoudige en robuuste protocol worden toegepast om weefsel-niveau organisatie van adipocyten en vet-ingezeten cellen, identificatie van subtype-specifieke marker genen, en ontwikkeling fenotypering van vet-selectieve knock-out / transgene muizen te bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een eenvoudige en robuuste methode om enkele kernen te isoleren en vetweefsel heterogeniteit te bestuderen wordt gepresenteerd. Vergeleken met whole tissue RNA sequencing biedt deze workflow een onbevooroordeeld beeld van cellulaire heterogeniteit en populatiespecifieke markers. Dit is significant en innovatief voor de vooruitgang van adipocyte biologie, moleculair metabolisme, en zwaarlijvigheidsonderzoek.
Dit protocol is speciaal geoptimaliseerd voor downstream toepassing van snRNA-seq. De “…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen David Reynolds van de Albert Einstein Genomics kern en Jinghang Zhang van de Flow Cytometry Core bedanken voor technische ondersteuning. We erkennen de steun van de National Institutes of Health (NIH) (DK110426) en Pilot and Feasibility Grants van het Einstein-Mount Sinai Diabetes Research Center (DK020541) en New York Obesity Research Center (DK026687) (allemaal naar K.S.). We willen ook Albert Einstein Cancer Center (CA013330) bedanken voor de kernondersteuning.
Materials
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | PBS with EDTA; sterile-filtered |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115 | |
| Cell filter 100 μm | Corning | 431752 | |
| Cell filter 40μm | Corning | 431750 | |
| CellTrics (30 μm) | Sysmex | 04-004-2326 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | Stackable filters |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| MoFloXDP Cell Sorter | Beckman Coulter | ML99030 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Protector RNase Inhibitor | Roche | 3335402001 | |
| Sucrose | Fisher | S5-3 |
References
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1518-1525 (2009).
- Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (2), E444-E452 (2007).
- Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).
- Yoneshiro, T., et al. Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans. The Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3404-3408 (2013).
- Cypess, A. M., et al. Activation of human brown adipose tissue by a β3-adrenergic receptor agonist. Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).
- Song, A., et al. Low- and high-thermogenic brown adipocyte subpopulations coexist in murine adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 247-257 (2020).
- Cinti, S., et al. CL316,243 and cold stress induce heterogeneous expression of UCP1 mRNA and protein in rodent brown adipocytes. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 50 (1), 21-31 (2002).
- Chen, Y., et al. Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state. Nature. 565 (7738), 180-185 (2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PloS One. 13 (12), e0209648 (2018).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous Transcriptional and Epigenomic Profiling from Specific Cell Types within Heterogeneous Tissues In Vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Zheng, G. X. Y., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049 (2017).
- Pollen, A. A., et al. Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex. Nature Biotechnology. 32 (10), 1053-1058 (2014).
- Hayashi, T., et al. Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs. Nature Communications. 9 (1), 619 (2018).
- Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37 (8), 925-936 (2019).
- Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).
- Peterson, V. M., et al. Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells. Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907 (2019).
