単細胞ゲノムアプリケーションのための脂肪組織核の分離
Summary
この出版物は、成熟したアディポサイトからの核の単離、蛍光活性化分類による精製、および単一細胞レベルのトランスクリプトミクスのためのプロトコルを記述する。
Abstract
ブラウンとベージュの脂肪は、UCP1(アンカップリングプロテイン-1)依存性および独立経路による熱発生のためのエネルギーを放散する特殊な脂肪組織である。最近まで、熱原性アディポサイトは均質集団と考えられていた。しかし、最近の研究では、発生起源、基質使用、およびトランスクリプトームに異なる複数のサブタイプまたは亜集団が存在することを示しています。単細胞ゲノミクスの進歩にもかかわらず、脂質で満たされた脂肪細胞の脆弱な性質のために、脂肪組織を細胞サブタイプに公平に分解することは困難であった。提示されたプロトコルは、RNAシーケンシングを含む下流のアプリケーションのための脂肪組織からの単一の核の効果的な分離によってこれらの障害を回避するために開発されました。細胞の不均一性は、RNAシーケンシングおよびバイオインフォマティクス解析によって分析することができます。
Introduction
研究は、茶色の脂肪組織(BAT)がエネルギーを消散する顕著な能力を有することを示している。げっ歯類とヒトの両方に、ベージュの藍胞と古典的な褐色のアディポサイトの両方に、明確な発達特徴を持つ熱原性のアディポサイトの2種類が存在する。古典的な褐色脂肪細胞は主に肩間BATデポに位置するが、ベージュ脂肪細胞は、慢性低温暴露のような特定の生理学的手がかりに応答して白い脂肪組織(WAT)に散発的に出現する、「褐変」または「ベイジング」と呼ばれるプロセスである。高度なイメージングを使用することにより、成人の人間がUCP1+ BATの実質的な拠点を持つことは明らかになっています, 特に上陸領域1,,22,3,,4.成人ヒトBATの量は、脂肪性と逆に相関し、慢性低温暴露55、6または6β3アドレナリン受容体アゴニスト7などの外部手がかりによって増加させることができる。BAT媒介エネルギー支出は、肥満と闘うための実行可能なアプローチを提供するかもしれない。
最近まで、熱原性のアディポサイトは均質な集団と考えられてきました。しかし、研究は、発達起源、基質の使用法、およびトランスクリプトーム88、9、109において明確である複数のサブタイプまたは亜集団の存在を10明らかにした。例えば、熱発生のためにグルコースを優先的に使用するベージュアディポサイトの一種である、g-ベージュアディポサイトは、最近10記載された。褐色およびベージュ脂肪組織における細胞タイプの不完全な理解と特定のマーカーの欠如は、その生物学的機能を研究するための重要な障壁を構成する。
細胞の亜集団を単離するための伝統的な方法は、少数の既知のマーカー遺伝子の発現に基づいています。単細胞ゲノミクスの最近の進歩により、単一細胞の全球遺伝子発現データを使用して、組織中の亜集団数の公平な推定値を提供することが可能です。このプロトコルの最終的な目標は、単一細胞の分解能で様々な発熱刺激の下ですべての脂肪組織サブタイプを決定することです。他の組織や細胞の種類とは対照的に、脂肪組織の細胞サブタイプを決定することは、脂質で満たされた脂肪細胞の脆弱性のために困難です。本論文では、下流の適用からsnRNAシーケンシングに対して、脂肪組織から単一核を分離するための堅牢なプロトコルを紹介する。重要なことに、よく一致した単核RNAシーケンシング(snRNA-seq)と単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)データセットを比較する最近の文献は、snRNA-seqが細胞型検出におけるscRNA-seqに匹敵し、脳11のような複雑な組織の細胞カバレッジにおいて優れていることが明らかになった。このプロトコルは、Rosenららによって脂肪組織に最適化された密度勾配遠心分離法をMoFlo XDP高速ソーターと核「クリーンアップ」ステップと組み合わせたものです。代表的な結果に見られるように、マウスの肩間ブラウン脂肪組織から7,500個の単一核の分析は、一見均質な褐色脂肪細胞内の複数の細胞タイプを同定した。全体として、この単純で堅牢なプロトコルは、脂肪細胞および脂肪居住細胞の組織レベルの組織化、サブタイプ特異的マーカー遺伝子の同定、および脂肪選択的ノックアウト/トランスジェニックマウスの開発表現型を研究するために適用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
単一の核を単一の核を単離し、脂肪組織の不均一性を研究する簡単で、強い方法が提示される。このワークフローは、組織全体のRNAシーケンシングと比較して、細胞の不均一性および集団特異的マーカーの公平なビューを提供します。これは、アディポサイト生物学、分子代謝、肥満研究の進歩のために重要かつ革新的です。
このプロトコルは、snRNA-seqのダウンストリ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
アルバート・アインシュタイン・ゲノミクスのコアのデビッド・レイノルズとフロー・サイトメトリー・コアのジンハン・ザンに、技術サポートを感謝します。我々は、国立衛生研究所(NIH)(DK110426)およびアインシュタインマウントシナイ糖尿病研究センター(DK020541)、ニューヨーク肥満研究センター(DK026687)(すべてK026687)からの支援を認める。.また、アルバート・アインシュタインがんセンター(CA013330)の中核的な支援に感謝したいと思います。
Materials
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | PBS with EDTA; sterile-filtered |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115 | |
| Cell filter 100 μm | Corning | 431752 | |
| Cell filter 40μm | Corning | 431750 | |
| CellTrics (30 μm) | Sysmex | 04-004-2326 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | Stackable filters |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| MoFloXDP Cell Sorter | Beckman Coulter | ML99030 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Protector RNase Inhibitor | Roche | 3335402001 | |
| Sucrose | Fisher | S5-3 |
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