단세포 게놈 응용을 위한 지방 조직 핵의 격리
Summary
본 간행물은 성숙한 지방세포로부터 핵의 분리, 형광 활성화 선별에 의한 정제, 및 단세포 수준 전사학에 대한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
갈색과 베이지 색 지방은 UCP1 (분리 단백질-1)에 의해 열발생에 대한 에너지를 발산하는 특수 조직 조직입니다 의존적이고 독립적 인 경로. 최근까지 열발생 성 지방 세포는 균일 한 인구로 간주되었다. 그러나, 최근 연구는 발달 기원, 기판 사용 및 전사에서 구별되는 다중 특수형 또는 하위 집단이 있다는 것을 표시했습니다. 단세포 유전체학의 진보에도 불구하고, 지방 분조직의 비편향분해는 지질이 채워진 지방세포의 연약한 특성 때문에 도전적이다. 제시된 프로토콜은 RNA 시퀀싱을 포함하여 다운스트림 응용을 위한 지방 조직에서 단 하나 핵의 효과적인 격리에 의해 이 장애물을 우회하기 위하여 개발되었습니다. 세포 이질성은 RNA 시퀀싱 및 생물정보 분석에 의해 분석될 수 있다.
Introduction
연구 에 따르면 갈색 지방 조직 (BAT)은 에너지를 분산시키는 놀라운 능력을 가지고 있습니다. 설치류와 인간 모두에서 뚜렷한 발달 기능을 갖춘 두 가지 유형의 열성 선포세포가 존재합니다: 베이지 색 지방 세포와 고전적인 갈색 지방세포. 고전적인 갈색 지방세포는 주로 중간 형 BAT 창고에 위치하지만, 베이지 색 지방 세포는 만성 감기 노출과 같은 특정 생리적 단서에 대한 응답으로 흰색 지방 조직 (WAT)에서 산발적으로 나타난다, 과정은 “브라우닝” 또는 “베이깅”으로 지칭되는 과정. 고급 이미징의 사용을 통해, 성인 인간은 UCP1+ BAT의 상당한 창고를 가지고 있음을 지금 분명하다, 특히 supraclavicular 영역1,,2,,3,,4. 성인 인간의 BAT의 양은 반대로 사도와 상관 관계가 있으며 만성 감기 노출5,,6 또는 β3-adrenergic 수용체고뇌7과같은 외부 단서에 의해 증가 될 수 있습니다. BAT 중재 에너지 지출은 비만 퇴치를 위한 실행 가능한 접근법을 제공할 수 있습니다.
최근까지 열발생 성 지방 세포는 균일 한 인구로 간주되었습니다. 그러나, 연구 결과는 발달 기원,,기판 사용 및전사8,9,910에서구별되는 다중 특수형 또는 하위 집단의 존재를 밝혔습니다. 예를 들어, 열발생, g-베이지 색 지방세포에 포도당을 우선적으로 사용하는 베이지 색 지방세포의 유형은 최근10에설명되었다. 갈색과 베이지 색 지방 조직에 있는 세포 모형의 불완전한 이해 및 특정 마커의 부족은 그들의 생물학 기능을 공부에 중요한 장벽을 구성합니다.
세포의 하위 집단을 격리하기위한 전통적인 방법은 몇 가지 알려진 마커 유전자의 발현에 기초한다. 단세포 유전체학에 있는 최근 어드밴스는 조직에 있는 하위 집단의 수의 편견없는 추정을 제공하기 위하여 단 하나 세포의 글로벌 유전자 발현 데이터의 사용을 가능하게 합니다. 이 프로토콜의 궁극적인 목표는 단세포 해상도에서 다양한 열발생 자극하에서 모든 지방 조직 특수형을 결정하는 것입니다. 다른 조직 및 세포 유형과는 달리, 지방 조직의 세포 하위 유형을 결정하는 것은 지질 채워진 지방 세포의 취약성 때문에 도전적입니다. 이 논문은 다운스트림 적용을 위한 지방 조직에서 snRNA 시퀀싱에 단일 핵을 분리하는 강력한 프로토콜을 소개합니다. 중요한 것은, 잘 일치하는 단일 핵 RNA 염기서열분석(snRNA-seq) 및 단세포 RNA 염기서열분석(scRNA-seq) 데이터 세트를 비교하는 최근 문헌은 snRNA-seq가 세포 유형 검출에서 scRNA-seq와 유사하며, 뇌111과같은 복잡한 조직에 대한 세포 커버리지에서 우수하다는 것을 밝혔다. 이 프로토콜은 로젠 외12에 의해 포화 조직에 최적화된 밀도 그라데이션 원심분리 방법을 MoFlo XDP 고속 선별기와 함께 핵 “정리” 단계와 결합합니다. 대표적인 결과에서 볼 수 있듯이, 마우스 산하 갈색 지방 조직에서 7,500개의 단일 핵을 분석한 결과, 겉보기에 균일한 갈색 지방 조직 내에서 여러 세포 유형을 확인했습니다. 전반적으로, 이 간단하고 강력한 프로토콜은 지방 세포및 지방 거주자 세포의 조직 수준 조직을 연구하기 위하여 적용될 수 있고, 아형 특이적 마커 유전자의 식별 및 adipose 선택적인 녹아웃/형질 전환 마우스의 발달 표현.
Protocol
Representative Results
Discussion
단일 핵을 분리하고 지방 조직 이질성을 연구하는 간단하고 견고한 방법이 제시됩니다. 전체 조직 RNA 시퀀싱에 비해,이 워크플로우는 세포 이질성 및 인구 별 마커의 편견보기를 제공합니다. 이것은 지방 세포 생물학, 분자 대사 및 비만 연구의 발전을 위해 중요하고 혁신적입니다.
이 프로토콜은 특히 snRNA-seq의 다운스트림 응용 프로그램에 최적화되어 있습니다. MoFlo XDP 고속…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 알버트 아인슈타인 유전체학 코어에서 데이비드 레이놀즈와 기술 지원을위한 흐름 사이토메트리 코어에서 징항 장 감사드립니다. 우리는 국립 보건원 (NIH) (DK110426) 및 아인슈타인 마운트 시나이 당뇨병 연구 센터 (DK020541) 및 뉴욕 비만 연구 센터 (DK026687)의 파일럿 및 타당성 보조금 (K.S.에 모두)의 지원을 인정합니다. 우리는 또한 핵심 지원에 대한 알버트 아인슈타인 암 센터 (CA013330)에 감사드립니다.
Materials
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | PBS with EDTA; sterile-filtered |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115 | |
| Cell filter 100 μm | Corning | 431752 | |
| Cell filter 40μm | Corning | 431750 | |
| CellTrics (30 μm) | Sysmex | 04-004-2326 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | Stackable filters |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| MoFloXDP Cell Sorter | Beckman Coulter | ML99030 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Protector RNase Inhibitor | Roche | 3335402001 | |
| Sucrose | Fisher | S5-3 |
References
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1518-1525 (2009).
- Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (2), E444-E452 (2007).
- Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).
- Yoneshiro, T., et al. Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans. The Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3404-3408 (2013).
- Cypess, A. M., et al. Activation of human brown adipose tissue by a β3-adrenergic receptor agonist. Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).
- Song, A., et al. Low- and high-thermogenic brown adipocyte subpopulations coexist in murine adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 247-257 (2020).
- Cinti, S., et al. CL316,243 and cold stress induce heterogeneous expression of UCP1 mRNA and protein in rodent brown adipocytes. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 50 (1), 21-31 (2002).
- Chen, Y., et al. Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state. Nature. 565 (7738), 180-185 (2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PloS One. 13 (12), e0209648 (2018).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous Transcriptional and Epigenomic Profiling from Specific Cell Types within Heterogeneous Tissues In Vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Zheng, G. X. Y., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049 (2017).
- Pollen, A. A., et al. Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex. Nature Biotechnology. 32 (10), 1053-1058 (2014).
- Hayashi, T., et al. Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs. Nature Communications. 9 (1), 619 (2018).
- Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37 (8), 925-936 (2019).
- Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).
- Peterson, V. M., et al. Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells. Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907 (2019).
