Cette publication décrit un protocole pour l’isolement des noyaux des adipocytes matures, la purification par le tri activé par fluorescence, et la transcriptomique de niveau unicellulaire.
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Article de méthode
Isolement des noyaux de tissus adipeux pour applications génomiques unicellulaires
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les graisses brunes et beiges sont des tissus adipeux spécialisés qui dissipent l’énergie pour la thermogenèse par ucp1 (Uncoupling Protein-1) --voies indépendantes. Jusqu’à récemment, les adipocytes thermogéniques étaient considérés comme une population homogène. Cependant, des études récentes ont indiqué qu’il existe plusieurs sous-types ou sous-populations qui sont distincts dans l’origine développementale, l’utilisation du substrat, et le transcriptome. Malgré les progrès de la génomique unicellulaire, la décomposition impartiale des tissus adipeux en sous-types cellulaires a été difficile en raison de la nature fragile des adipocytes remplis de lipides. Le protocole présenté a été développé pour contourner ces obstacles par l’isolement efficace des noyaux simples des tissus adipeux pour les applications en aval, y compris le séquençage de l’ARN. L’hétérogénéité cellulaire peut ensuite être analysée par séquençage de l’ARN et des analyses bioinformatiques.
Introduction
Des études ont montré que le tissu adipeux brun (BAT) a une capacité remarquable de dissiper l’énergie. Deux types d’adipocytes thermogéniques avec des caractéristiques développementales distinctes existent chez les rongeurs et les humains : les adipocytes beiges et les adipocytes bruns classiques. Alors que les adipocytes bruns classiques sont situés principalement dans les dépôts de BAT interscapulaires, les adipocytes beiges émergent sporadiquement dans le tissu adipeux blanc (WAT) en réponse à certains indices physiologiques, tels que l’exposition chronique au froid, un processus appelé « brunissement » ou « beiging ». Grâce à l’utilisation de l’imagerie avancée, ....
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Protocole
Les soins et l’expérimentation des animaux ont été effectués selon les procédures approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Albert Einstein College of Medicine.
1. Préparation des tampons de digestion des tissus et de lyse
- Préparer le tampon de digestion des tissus.
- Préparer ~1 mL de tampon de digestion pour chaque gramme de tissu adipeux.
- Peser 1,5 collagènease U/mL D et 2,4 U/mL dispase II et ajouter la solution saline tamponnée de phosphate (PBS).
- Préparer le tampon de préparation des noyaux (CNLC).
- Préparer 10 mM HEPES, 1,5 mM de chlorur....
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Résultats
Les noyaux d’adipocytes non triés contiennent des débris et des doublets qui créent du bruit et un fond élevé dans le séquençage de l’ARN unicellulaire en aval. La stratégie représentative de porte FACS est indiquée à la figure 1. Les noyaux ont d’abord été sélectionnés en fonction de la diffusion vers l’avant (FSC) et de la dispersion latérale (SSC) (A),puis, seuls les singlets ont été sélectionnés en fonction de la combinaison de la largeur.......
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Discussion
Une méthode simple et robuste pour isoler les noyaux simples et étudier l’hétérogénéité des tissus adipeux est présentée. Comparé au séquençage de l’ARN des tissus entiers, ce flux de travail offre une vue impartiale de l’hétérogénéité cellulaire et des marqueurs spécifiques à la population. Ceci est significatif et novateur pour l’avancement de la biologie des adipocytes, du métabolisme moléculaire et de la recherche sur l’obésité.
Ce protocole est particulièrement optimisé pour l’application.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Nous tenons à remercier David Reynolds du noyau Albert Einstein Genomics et Jinghang Zhang du Flow Cytometry Core pour son soutien technique. Nous reconnaissons le soutien des National Institutes of Health (NIH) (DK110426) et des subventions pilotes et de faisabilité du Centre de recherche sur le diabète Einstein-Mount Sinai (DK020541) et du New York Obesity Research Center (DK026687) (tous à K.S.). Nous tenons également à remercier Albert Einstein Cancer Center (CA013330) pour le soutien de base.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| solution de rinçage autoMACS | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | PBS avec EDTA ; stérile à filtre |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115 | |
| Filtre à cellules 100 &mu ; m | Corning | 431752 | |
| Filtre à cellules 40&mu ; m | Corning | 431750 | |
| CellTrics (30 &mu ; m) | Sysmex | 04-004-2326 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Countess II FL Compteur de cellules automatisé | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| MACS SmartStrainers (30 & micro ; m) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | Filtres empilables |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| MoFloXDP Trieur de cellules | Beckman Coulter | ML99030 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Protector Inhibiteur de RNase | Roche | 3335402001 | |
| Saccharose | Fisher | S5-3 |
Références
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in....
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Réimpressions et autorisations
