Summary

Isolering av fettvevskjerner for encellede genomiske applikasjoner

Published: June 12, 2020
doi:

Summary

Denne publikasjonen beskriver en protokoll for isolering av kjerner fra modne adicytter, rensing av fluorescensaktivert sortering og encellede nivåtranskripsjon.

Abstract

Brunt og beige fett er spesialisert fettvev som sprer energi for termotilblivelsen ved UCP1 (Frakobling protein-1)-avhengige og uavhengige veier. Inntil nylig ble thermogenic adicytter ansett som en homogen populasjon. Nyere studier har imidlertid indikert at det er flere undertyper eller underpopulasjoner som er forskjellige i utviklingsopprinnelse, substratbruk og transkripsjon. Til tross for fremskritt i encellede genomikk har objektiv nedbrytning av fettvev i cellulære undertyper vært utfordrende på grunn av den skjøre naturen til lipidfylte adipocytes. Protokollen som ble presentert ble utviklet for å omgå disse hindringene ved effektiv isolering av enkeltkjerner fra fettvev for nedstrøms applikasjoner, inkludert RNA-sekvensering. Cellulær heterogenitet kan deretter analyseres ved RNA-sekvensering og bioinformatiske analyser.

Introduction

Studier har vist at brunt fettvev (BAT) har en bemerkelsesverdig evne til å spre energi. To typer thermogenic adicytter med forskjellige utviklingsegenskaper finnes hos både gnagere og mennesker: beige adicytter og klassiske brune adicytter. Mens klassiske brune adiipocytes ligger for det meste i interscapular BAT depoter, beige adiipocytes sporadisk dukke opp i hvitt fettvev (WAT) som svar på visse fysiologiske signaler, for eksempel kronisk kald eksponering, en prosess referert til som eller beiging. Gjennom bruk av avansert bildebehandling er det nå klart at voksne mennesker har betydelige depoter av UCP1+ BAT, spesielt i supraclavicular regionen1,2,3,4. Mengden av voksne menneskelige BAT inverst korrelerer med adiposity og kan økes med eksterne signaler, for eksempel kronisk kald eksponering5,,6 eller β3-adrenerge reseptoragonist7. BAT-mediert energiforbruk kan tilby en levedyktig tilnærming til bekjempelse av fedme.

Inntil nylig har thermogenic adicytter blitt ansett som en homogen populasjon. Studier har imidlertid avdekket eksistensen av flere undertyper eller underpopulasjoner som er forskjellige i utviklingsmessig opprinnelse, substratbruk og transkripsjon8,9,10. For eksempel ble en type beige adiipocyte som fortrinnsvis bruker glukose for termotilblivelsen, g-beige adicytt, nylig beskrevet10. Den ufullstendige forståelsen av celletyper i brunt og beige fettvev og mangelen på spesifikke markører utgjør en kritisk barriere for å studere deres biologiske funksjoner.

Tradisjonelle metoder for å isolere underpopulasjoner av celler er basert på uttrykk for bare noen få kjente markørgener. Nylige fremskritt innen encellede genomikk gjør det mulig å bruke globale genuttrykksdata for enkeltceller for å gi et objektivt estimat av antall underpopulasjoner i et vev. Det endelige målet med denne protokollen er å bestemme alle fettvevsundertyper under ulike thermogenic stimuli ved en enkeltcelleoppløsning. I motsetning til andre vev og celletyper, bestemme cellulære undertyper av fettvev er utfordrende på grunn av skjørhet av lipid-fylt adipocytter. Dette papiret introduserer en robust protokoll for å isolere enkeltkjerner fra fettvev for nedstrøms bruk til snRNA sekvensering. Viktigere, nyere litteratur sammenligne godt matchet single-nuclei RNA sekvensering (snRNA-seq) og encellet RNA sekvensering (scRNA-seq) datasett viste at snRNA-seq er sammenlignbar med scRNA-seq i celletype deteksjon, og overlegen i cellulær dekning for et komplekst vev som hjernen11. Denne protokollen kombinerer en tetthet gradering sentrifugation metode optimalisert for fett vev av Rosen et al.12 med en kjerne “opprydding” trinn med en MoFlo XDP High Speed Sorter. Som sett i de representative resultatene, identifiserte en analyse av 7500 enkeltkjerner fra mus interscapular brunt fettvev flere celletyper i tilsynelatende homogene brune adiipocytes. Samlet sett kan denne enkle og robuste protokollen brukes til å studere organareorganisering av adipocytter og fett-resident celler, identifisering av subtypespesifikke markørgener og utvikling fenotyping av fettselektive knockout / transgene mus.

Protocol

Dyrepleie og eksperimentering ble utført i henhold til prosedyrer godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Albert Einstein College of Medicine. 1. Utarbeidelse av vev fordøyelse og lysis buffere Forbered vev fordøyelsesbuffer. Forbered ~ 1 ml fordøyelsesbuffer for hvert gram fettvev. Vei ut 1,5 U/ml kollagenase D og 2,4 U/ml dispase II og tilsett fosfatbufret saltvann (PBS). Klargjør nukleos klargjøringsbuffer (NPB).<…

Representative Results

Usorterte adipocytter inneholder rusk og doblere som skaper støy og høy bakgrunn i nedstrøms encellede RNA-sekvensering. Den representative FACS gate-strategien vises i figur 1. Kjernene ble først valgt basert på forover scatter (FSC) og side scatter (SSC) (A), da ble bare singleter valgt basert på kombinasjonen av bredde og høyder av SSC (B). Til slutt ble bare DAPI-positive hendelser valgt og sortert i oppsamlingsbuf…

Discussion

En enkel og robust metode for å isolere enkeltkjerner og studere fettvev heterogenitet presenteres. Sammenlignet med hele vev RNA sekvensering, denne arbeidsflyten tilbyr en objektiv visning av cellulær heterogenitet og populasjonsspesifikke markører. Dette er betydelig og nyskapende for fremme av adicyttbiologi, molekylær metabolisme, og fedme forskning.

Denne protokollen er spesielt optimalisert for nedstrøms bruk av snRNA-seq. “Opprydding” trinn for å oppnå isolasjon av sunne kjerner…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vil gjerne takke David Reynolds fra Albert Einstein Genomics-kjernen og Jinghang Zhang fra Flow Cytometry Core for teknisk støtte. Vi anerkjenner støtte fra National Institutes of Health (NIH) (DK110426) og Pilot and Feasibility Grants fra Einstein-Mount Sinai Diabetes Research Center (DK020541) og New York Obesity Research Center (DK026687) (alle til K.S.). Vi vil også takke Albert Einstein Cancer Center (CA013330) for kjernestøtte.

Materials

autoMACS Rinsing Solution Miltenyi Biotec 130-091-222 PBS with EDTA; sterile-filtered
BSA Sigma A1595
CaCl2 Sigma 21115
Cell filter 100 μm Corning 431752
Cell filter 40μm Corning 431750
CellTrics (30 μm) Sysmex 04-004-2326
Collagenase D Roche 11088866001
Countess II FL Automated Cell Counter Invitrogen AMQAF1000
DAPI Sigma D9542
Dispase II Roche 4942078001
HEPES Sigma H4034
KCl Fisher P217-3
MACS SmartStrainers (30 µm) Miltenyi Biotec 130-098-458 Stackable filters
MgCl2 Sigma M1028
MoFloXDP Cell Sorter Beckman Coulter ML99030
NP-40 Sigma 74385
Protector RNase Inhibitor Roche 3335402001
Sucrose Fisher S5-3

References

  1. Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).
  2. van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).
  3. Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1518-1525 (2009).
  4. Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (2), E444-E452 (2007).
  5. Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).
  6. Yoneshiro, T., et al. Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans. The Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3404-3408 (2013).
  7. Cypess, A. M., et al. Activation of human brown adipose tissue by a β3-adrenergic receptor agonist. Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).
  8. Song, A., et al. Low- and high-thermogenic brown adipocyte subpopulations coexist in murine adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 247-257 (2020).
  9. Cinti, S., et al. CL316,243 and cold stress induce heterogeneous expression of UCP1 mRNA and protein in rodent brown adipocytes. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 50 (1), 21-31 (2002).
  10. Chen, Y., et al. Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state. Nature. 565 (7738), 180-185 (2019).
  11. Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PloS One. 13 (12), e0209648 (2018).
  12. Roh, H. C., et al. Simultaneous Transcriptional and Epigenomic Profiling from Specific Cell Types within Heterogeneous Tissues In Vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
  13. Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
  14. Zheng, G. X. Y., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049 (2017).
  15. Pollen, A. A., et al. Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex. Nature Biotechnology. 32 (10), 1053-1058 (2014).
  16. Hayashi, T., et al. Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs. Nature Communications. 9 (1), 619 (2018).
  17. Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37 (8), 925-936 (2019).
  18. Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).
  19. Peterson, V. M., et al. Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells. Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).
  20. Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907 (2019).
check_url/fr/61230?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
Benitez, G. J., Shinoda, K. Isolation of Adipose Tissue Nuclei for Single-Cell Genomic Applications. J. Vis. Exp. (160), e61230, doi:10.3791/61230 (2020).

View Video