Denne publikasjonen beskriver en protokoll for isolering av kjerner fra modne adicytter, rensing av fluorescensaktivert sortering og encellede nivåtranskripsjon.
Brunt og beige fett er spesialisert fettvev som sprer energi for termotilblivelsen ved UCP1 (Frakobling protein-1)-avhengige og uavhengige veier. Inntil nylig ble thermogenic adicytter ansett som en homogen populasjon. Nyere studier har imidlertid indikert at det er flere undertyper eller underpopulasjoner som er forskjellige i utviklingsopprinnelse, substratbruk og transkripsjon. Til tross for fremskritt i encellede genomikk har objektiv nedbrytning av fettvev i cellulære undertyper vært utfordrende på grunn av den skjøre naturen til lipidfylte adipocytes. Protokollen som ble presentert ble utviklet for å omgå disse hindringene ved effektiv isolering av enkeltkjerner fra fettvev for nedstrøms applikasjoner, inkludert RNA-sekvensering. Cellulær heterogenitet kan deretter analyseres ved RNA-sekvensering og bioinformatiske analyser.
Studier har vist at brunt fettvev (BAT) har en bemerkelsesverdig evne til å spre energi. To typer thermogenic adicytter med forskjellige utviklingsegenskaper finnes hos både gnagere og mennesker: beige adicytter og klassiske brune adicytter. Mens klassiske brune adiipocytes ligger for det meste i interscapular BAT depoter, beige adiipocytes sporadisk dukke opp i hvitt fettvev (WAT) som svar på visse fysiologiske signaler, for eksempel kronisk kald eksponering, en prosess referert til som eller beiging. Gjennom bruk av avansert bildebehandling er det nå klart at voksne mennesker har betydelige depoter av UCP1+ BAT, spesielt i supraclavicular regionen1,2,3,4. Mengden av voksne menneskelige BAT inverst korrelerer med adiposity og kan økes med eksterne signaler, for eksempel kronisk kald eksponering5,,6 eller β3-adrenerge reseptoragonist7. BAT-mediert energiforbruk kan tilby en levedyktig tilnærming til bekjempelse av fedme.
Inntil nylig har thermogenic adicytter blitt ansett som en homogen populasjon. Studier har imidlertid avdekket eksistensen av flere undertyper eller underpopulasjoner som er forskjellige i utviklingsmessig opprinnelse, substratbruk og transkripsjon8,9,10. For eksempel ble en type beige adiipocyte som fortrinnsvis bruker glukose for termotilblivelsen, g-beige adicytt, nylig beskrevet10. Den ufullstendige forståelsen av celletyper i brunt og beige fettvev og mangelen på spesifikke markører utgjør en kritisk barriere for å studere deres biologiske funksjoner.
Tradisjonelle metoder for å isolere underpopulasjoner av celler er basert på uttrykk for bare noen få kjente markørgener. Nylige fremskritt innen encellede genomikk gjør det mulig å bruke globale genuttrykksdata for enkeltceller for å gi et objektivt estimat av antall underpopulasjoner i et vev. Det endelige målet med denne protokollen er å bestemme alle fettvevsundertyper under ulike thermogenic stimuli ved en enkeltcelleoppløsning. I motsetning til andre vev og celletyper, bestemme cellulære undertyper av fettvev er utfordrende på grunn av skjørhet av lipid-fylt adipocytter. Dette papiret introduserer en robust protokoll for å isolere enkeltkjerner fra fettvev for nedstrøms bruk til snRNA sekvensering. Viktigere, nyere litteratur sammenligne godt matchet single-nuclei RNA sekvensering (snRNA-seq) og encellet RNA sekvensering (scRNA-seq) datasett viste at snRNA-seq er sammenlignbar med scRNA-seq i celletype deteksjon, og overlegen i cellulær dekning for et komplekst vev som hjernen11. Denne protokollen kombinerer en tetthet gradering sentrifugation metode optimalisert for fett vev av Rosen et al.12 med en kjerne “opprydding” trinn med en MoFlo XDP High Speed Sorter. Som sett i de representative resultatene, identifiserte en analyse av 7500 enkeltkjerner fra mus interscapular brunt fettvev flere celletyper i tilsynelatende homogene brune adiipocytes. Samlet sett kan denne enkle og robuste protokollen brukes til å studere organareorganisering av adipocytter og fett-resident celler, identifisering av subtypespesifikke markørgener og utvikling fenotyping av fettselektive knockout / transgene mus.
En enkel og robust metode for å isolere enkeltkjerner og studere fettvev heterogenitet presenteres. Sammenlignet med hele vev RNA sekvensering, denne arbeidsflyten tilbyr en objektiv visning av cellulær heterogenitet og populasjonsspesifikke markører. Dette er betydelig og nyskapende for fremme av adicyttbiologi, molekylær metabolisme, og fedme forskning.
Denne protokollen er spesielt optimalisert for nedstrøms bruk av snRNA-seq. “Opprydding” trinn for å oppnå isolasjon av sunne kjerner…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke David Reynolds fra Albert Einstein Genomics-kjernen og Jinghang Zhang fra Flow Cytometry Core for teknisk støtte. Vi anerkjenner støtte fra National Institutes of Health (NIH) (DK110426) og Pilot and Feasibility Grants fra Einstein-Mount Sinai Diabetes Research Center (DK020541) og New York Obesity Research Center (DK026687) (alle til K.S.). Vi vil også takke Albert Einstein Cancer Center (CA013330) for kjernestøtte.
autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | PBS with EDTA; sterile-filtered |
BSA | Sigma | A1595 | |
CaCl2 | Sigma | 21115 | |
Cell filter 100 μm | Corning | 431752 | |
Cell filter 40μm | Corning | 431750 | |
CellTrics (30 μm) | Sysmex | 04-004-2326 | |
Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
DAPI | Sigma | D9542 | |
Dispase II | Roche | 4942078001 | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
KCl | Fisher | P217-3 | |
MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | Stackable filters |
MgCl2 | Sigma | M1028 | |
MoFloXDP Cell Sorter | Beckman Coulter | ML99030 | |
NP-40 | Sigma | 74385 | |
Protector RNase Inhibitor | Roche | 3335402001 | |
Sucrose | Fisher | S5-3 |