Ensayo mejorado de fecundidad y fertilidad para Aedes aegypti utilizando 24 placas de cultivo de tejidos de pozos (placas EAgaL)
Summary
Descrito es un método de ahorro de tiempo y espacio para contar los huevos y determinar las tasas de eclosión de mosquitos individuales utilizando 24 placas de cultivo de tejido de pozos, lo que puede aumentar sustancialmente la escala y la velocidad de los ensayos de fecundidad y fertilidad.
Abstract
Los mosquitos representan un importante problema de salud pública como vectores de diversos patógenos. Para aquellos estudios que requieren una evaluación de los parámetros de aptitud de los mosquitos, en particular la producción de huevos y las tasas de eclosión a nivel individual, los métodos convencionales han puesto una carga sustancial en los investigadores debido a la alta intensidad de mano de obra y los requisitos de espacio de laboratorio. Descrito es un método simple que utiliza la placa de cultivo de tejido de 24 pozos con agarosa en cada pozo y la proyección de imagen digital de cada pozo para determinar números del huevo y índices de la eclosión en un nivel individual con requisitos substancialmente reducidos del tiempo y del espacio.
Introduction
El control de los mosquitos para proteger a los seres humanos de los patógenos transmitidos por vectores es un objetivo importante de salud pública, principalmente debido a la falta de vacunas efectivas para la mayoría de los patógenos transportados por los mosquitos. Muchos estudios tienen como objetivo reducir la aptitud de los mosquitos junto con una estrategia de reducción de la población aplicable en el campo1,2,3. Esto incluye amplios estudios para crear mosquitos transgénicos y/o líneas de knockout CRISPR/Cas9. Estos enfoques de modificación de la población requieren una evaluación detallada de los parámetros individuales de aptitud4. Las técnicas de laboratorio convencionales para evaluar la aptitud de los mosquitos hembra incluyen la contención individual de mosquitos hembra apareados y alimentados con sangre en contenedores de 100 mL5,tubos cónicos modificados de 50 mL, o tubos para la cría de Drosophila modificados mediante el suministro de superficies húmedas utilizando discos húmedos de algodón y papel de filtro para la oviposición (es decir, papeles de huevo)1,2,6,7. Tales métodos requieren un espacio relativamente grande (por ejemplo, 30 cm x 30 cm x 10 cm: W x L x H para hasta 100 tubos de Drosophila) (Figura 1),y la manipulación de papeles de huevo individuales para contar huevos y larvas de eclosión, que pueden ser intensivos en mano de obra. Este manuscrito presenta un método para contar los huevos de mosquitos y determinar las tasas de eclosión utilizando 24 placas de pozos y agarosa como superficie de oviposición para evitar estos problemas8.
Simultáneamente, Ioshino et al.9 describieron un método detallado utilizando placas de 12 y 24 pozos para realizar el conteo de huevos obtenidos de hembras individuales. Su protocolo representó una mejora significativa de los métodos convencionales en el ahorro de tiempo y espacio9. Sin embargo, el protocolo que describieron continúa utilizando papel de filtro húmedo como superficie para la oviposición, lo que requiere desplegar cada papel individual para obtener recuentos, ya que los huevos a menudo se encuentran debajo o en pliegues. Su protocolo tampoco incluyó el uso de tecnologías de imágenes o un método para el conteo de larvas.
Se presenta un método mejorado para realizar ensayos de aptitud para el número de huevos (es decir, fecundidad) y la tasa de eclosión (es decir, fertilidad) utilizando agarosa como superficie de oviposición en un formato de placa de cultivo de tejido de 24 pozos para Ae. aegypti que oviposita en superficies húmedas. Estas placas fueron nombradas placas “EAgaL”, de Egg, Agarose, y Larva. Estas placas de 24 pozos proporcionan a los mosquitos individuales una superficie mínima para poner huevos, simplificando y reduciendo drásticamente el tiempo y el esfuerzo necesarios para contar y mantener los huevos y las larvas eclosionadas durante unos días. La placa EAgaL utiliza agarosa translúcida para la superficie de oviposición, lo que elimina la necesidad de manipular papeles de huevo y encontrar los huevos y larvas cuando eclosionan; fotografiar cada pozo establece un registro archivado a largo plazo de los resultados y separa el proceso de conteo tanto en tiempo como en espacio del proceso de cría / manipulación, donde el tiempo a menudo es limitado.
Protocol
Representative Results
Discussion
La placa EAgaL reduce drásticamente el trabajo de parto, el tiempo y el espacio para realizar ensayos individuales de fecundidad y fertilidad en Aedes aegypti en comparación con el método FT. La comparación preliminar entre el método de FT y la placa de EAgaL resultó en tiempos más cortos para todos los pasos (se aplicó la técnica de imagen al método de FT) (Tabla 1). Como referencia, en la Tabla 2 se proporciona una estimación de los costos de inicio y por ensayo (una placa …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Texas A&M Agrilife Research Insect Vectored Diseases Grant Program por su financiamiento. También agradecemos a los miembros del laboratorio de Adelman por su ayuda en el desarrollo de este método y sugerencias al redactar el manuscrito, así como a los miembros del laboratorio de Kevin Myles. También agradecemos a los revisores y editores por su ayuda para mejorar este manuscrito.
Materials
| 1.6 mm Φ drill bit | alternatively heated nails can be used | ||
| 1000 μL pipette tips (long) | Olympus plastics | 24-165RL | |
| 24-well tissue culture plate | Thermo Scientific | 930186 | clear, flat-bottom with ringed lid plates |
| Agarose | VWR | 0710-500G | |
| Compact digital camera | Olympus | TG-5/TG-6 | |
| Computer (Windows, Mac or Linux) | |||
| Deionized water | |||
| Fiji (imageJ) software | download from: https://fiji.sc/ | ||
| Forceps | Dumont | sharp forceps may break mosquito's body | |
| Glass Petri dishes | VWR | ||
| Household bleach | |||
| Household electric drill | |||
| illuminator for stereomicroscope (gooseneck) | |||
| P-1000 pipette | Gilson | ||
| paint brushes | |||
| Rubber bands | |||
| SD card | to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better) | ||
| Spreadsheet software (Microsoft Excel) | Microsoft | Any spreadsheet software works | |
| TetraMin fish food | Tetra | ground with coffee grinder, blender or morter & pestle | |
| Transfer pipetts | VWR | 16011-188 |
References
- Bond, J. G., et al. Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program. PLoS One. 14 (2), 0212520 (2019).
- Fernandes, K. M., et al. Aedes aegypti larvae treated with spinosad produce adults with damaged midgut and reduced fecundity. Chemosphere. 221, 464-470 (2019).
- Inocente, E. A., et al. Insecticidal and Antifeedant Activities of Malagasy Medicinal Plant (Cinnamosma sp.) Extracts and Drimane-Type Sesquiterpenes against Aedes aegypti Mosquitoes. Insects. 10 (11), 373 (2019).
- Marrelli, M. T., Moreira, C. K., Kelly, D., Alphey, L., Jacobs-Lorena, M. Mosquito transgenesis: what is the fitness cost. Trends in Parasitology. 22 (5), 197-202 (2006).
- da Silva Costa, G., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. Toward a blood-free diet for Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. , 217 (2019).
- Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti. PeerJ. 3, 938 (2015).
- Gonzales, K. K., et al. The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement, on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota. Scientific Reports. 8 (1), 11023 (2018).
- Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of Candidate Iron Transporters From the ZIP/ZnT Gene Families in the Mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
- Ioshino, R. S., et al. Oviplate: A Convenient and Space-Saving Method to Perform Individual Oviposition Assays in Aedes aegypti. Insects. 9 (3), 103 (2018).
- Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti. Parasites & Vectors. 8, 252 (2015).
- Valerio, L., Matilda Collins, C., Lees, R. S., Benedict, M. Q. Benchmarking vector arthropod culture: an example using the African malaria mosquito, Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae). Malaria Journal. 15 (1), 262 (2016).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
