Verbesserte Fecundity und Fruchtbarkeit Assay für Aedes aegypti mit 24 Well Tissue Culture Platten (EAgaL Platten)
Summary
Beschrieben wird eine zeit- und platzsparende Methode zur Zählung von Eiern und zur Bestimmung der Brutraten einzelner Mücken anhand von 24 Brunnengewebekulturplatten, die den Umfang und die Geschwindigkeit von Fruchtbarkeits- und Fruchtbarkeitstests erheblich erhöhen können.
Abstract
Mücken stellen ein erhebliches Problem der öffentlichen Gesundheit als Vektoren verschiedener Krankheitserreger dar. Für Studien, die eine Bewertung der Mückenfitnessparameter, insbesondere der Eiproduktion und der Schraffurraten auf individueller Ebene, erfordern, haben herkömmliche Methoden die Forscher aufgrund der hohen Arbeitsintensität und des Laborraumbedarfs erheblich belastet. Beschrieben wird eine einfache Methode mit 24 Brunnengewebe-Kulturplatte mit Agarose in jedem Brunnen und digitale Bildgebung von jedem Brunnen, um Eizahlen und Schraffurraten auf individueller Ebene mit erheblich reduziertem Zeit- und Platzbedarf zu bestimmen.
Introduction
Die Bekämpfung von Stechmücken zum Schutz des Menschen vor vektorübertragenen Krankheitserregern ist ein wichtiges Ziel für die öffentliche Gesundheit, vor allem aufgrund des Mangels an wirksamen Impfstoffen für die meisten Von Mücken übertragenen Krankheitserreger. Viele Studien zielen darauf ab, die Mückenfitness in Verbindung mit einer feldtauglichen Bevölkerungsreduktionsstrategie1,2,3zureduzieren. Dazu gehören umfangreiche Studien zur Herstellung transgener Mücken und/oder CRISPR/Cas9-Knockout-Linien. Solche Ansätze zur Bevölkerungsmodifikation erfordern eine detaillierte Bewertung der einzelnen Fitnessparameter4. Herkömmliche Labortechniken zur Beurteilung der Tauglichkeit weiblicher Mücken umfassen die individuelle Eindämmung von gepaarten, blutgefütterten weiblichen Mücken in 100 ml Behältern5, modifizierte 50 ml konische Schläuche oder Röhren für die Drosophila-Aufzucht modifiziert durch bereitstellung feuchter Oberflächen mit feuchter Baumwolle und Filterpapierscheiben für die Eioposition (d.h. Eipapiere)1,2,6,7. Solche Methoden erfordern einen relativ großen Raum (z.B. 30 cm x 30 cm x 10 cm: B x L x H für bis zu 100 Drosophila-Röhren) (Abbildung 1) und die Manipulation einzelner Eipapiere zum Zählen von Eiern und Brutlarven, die arbeitsintensiv sein können. Dieses Manuskript stellt eine Methode zur Zählung von Mückeneiern und zur Bestimmung der Schraffurraten anhand von 24 Brunnenplatten und Agarose als Eileiteroberfläche dar, um diese Probleme zu umgehen8.
Gleichzeitig beschrieben Ioshino et al.9 eine detaillierte Methode mit 12 und 24 Brunnenplatten zur Durchführung von Eizählungen, die von einzelnen Weibchen erhalten wurden. Ihr Protokoll stellte eine deutliche Verbesserung gegenüber herkömmlichen Methoden bei der Einsparung von Zeit und Platz9dar. Das von ihnen beschriebene Protokoll verwendet jedoch weiterhin nasses Filterpapier als Oberfläche für die Eileiterung, die das Entfalten jedes einzelnen Papiers erfordert, um Zählungen zu erhalten, da Eier oft unter oder in Falten gefunden werden. Ihr Protokoll enthielt auch nicht den Einsatz von Bildgebungstechnologien oder eine Methode zur Larvenzählung.
Präsentiert wird eine verbesserte Methode zur Durchführung von Fitness-Assays für Eizahl (d.h. Fruchtbarkeit) und Schraffurrate (d.h. Fruchtbarkeit) mit Agarose als Ovipositionsoberfläche in einem 24-Well-Gewebe-Kultur-Plattenformat für Ae. aegypti, das auf feuchten Oberflächen oviposit. Diese Platten wurden “EAgaL” Platten genannt, von Egg, Agarose, und Larva. Diese 24 Brunnenplatten bieten einzelnen Mücken eine minimale Oberfläche zum Legen von Eiern, wodurch die Zeit und der Aufwand für die Zählung und Pflege von Eiern und geschlüpften Larven für einige Tage vereinfacht und drastisch reduziert werden. Die EAgaL-Platte verwendet transluzente Agarose für die Eileiteroberfläche, die den Umgang mit Eipapieren und das Auffinden der Eier und Larven beim Schlüpfen überflüssig macht; Das Fotografieren jedes Brunnens erstellt eine langfristig archivierte Aufzeichnung der Ergebnisse und trennt den Zählprozess sowohl zeitlich als auch räumsfrei vom Aufzucht-/Handlingprozess, bei dem die Zeit oft begrenzt ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die EAgaL-Platte reduziert Arbeit, Zeit und Raum drastisch, um individuelle Fruchtbarkeits- und Fruchtbarkeitstests in Aedes aegypti im Vergleich zur FT-Methode durchzuführen. Ein vorläufiger Vergleich zwischen der FT-Methode und der EAgaL-Platte führte zu kürzeren Zeiten für alle Schritte (imaging technique wurde auf die FT-Methode angewendet) (Tabelle 1). Als Referenz ist in Tabelle 2eine Schätzung der Anlauf- und Pro-Assay-Kosten (eine 24-Well-EAgaL-Platte gege…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Texas A&M Agrilife Research Insect Vectored Diseases Grant Program für die Finanzierung. Wir danken auch den Mitgliedern des Adelman-Labors für die Unterstützung bei der Entwicklung dieser Methode und Anregungen bei der Erstellung des Manuskripts sowie den Mitgliedern des Kevin Myles-Labors. Wir danken auch den Rezensenten und Redakteuren für ihre Hilfe, um dieses Manuskript besser zu machen.
Materials
| 1.6 mm Φ drill bit | alternatively heated nails can be used | ||
| 1000 μL pipette tips (long) | Olympus plastics | 24-165RL | |
| 24-well tissue culture plate | Thermo Scientific | 930186 | clear, flat-bottom with ringed lid plates |
| Agarose | VWR | 0710-500G | |
| Compact digital camera | Olympus | TG-5/TG-6 | |
| Computer (Windows, Mac or Linux) | |||
| Deionized water | |||
| Fiji (imageJ) software | download from: https://fiji.sc/ | ||
| Forceps | Dumont | sharp forceps may break mosquito's body | |
| Glass Petri dishes | VWR | ||
| Household bleach | |||
| Household electric drill | |||
| illuminator for stereomicroscope (gooseneck) | |||
| P-1000 pipette | Gilson | ||
| paint brushes | |||
| Rubber bands | |||
| SD card | to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better) | ||
| Spreadsheet software (Microsoft Excel) | Microsoft | Any spreadsheet software works | |
| TetraMin fish food | Tetra | ground with coffee grinder, blender or morter & pestle | |
| Transfer pipetts | VWR | 16011-188 |
References
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