24ウェル組織培養プレート(EAgaLプレート)を用いた Aedes aegypti のフェクアンディティと不妊治療アッセイの改善
Summary
記載されているのは、卵を数え、24個の井戸組織培養プレートを使用して個々の蚊の孵化率を決定する時間と省スペースの方法であり、これは胎児性および生殖能力アッセイの規模と速度を大幅に増加させることができる。
Abstract
蚊は、様々な病原体のベクターとして重大な公衆衛生上の問題を表しています。蚊のフィットネスパラメータ、特に個々のレベルでの卵の生産と孵化率の評価を必要とするこれらの研究のために、従来の方法は、高い労働強度と実験室スペース要件のために調査官に大きな負担をかけている。説明は、各ウェルにアガロースを有する24ウェル組織培養プレート及び各ウェルのデジタルイメージングを用いた簡単な方法であり、時間と空間の要件を大幅に削減した個々のレベルで卵数およびハッチ率を決定する。
Introduction
ベクター媒介病原体からヒトを保護するための蚊の防除は、主に蚊によって運ばれるほとんどの病原体に対する効果的なワクチンの欠如のために、重要な公衆衛生目標である。多くの研究は、フィールドに適用可能な人口減少戦略1、2、3と組み合わせて蚊のフィットネスを減らすことを目指しています。これには、トランスジェニック蚊および/またはCRISPR / Cas9ノックアウトラインを作成するための広範な研究が含まれます。このような人口改変アプローチは、個々のフィットネスパラメータ4の詳細な評価を必要とする。雌の蚊の適性を評価するための従来の実験室技術は、100 mL容器内の交配された血液を与えられた雌の蚊の個々の封じ込めを含む5、50mL円錐管を改変、または浸出のための湿った綿およびフィルターペーパーディスクを使用して湿った表面を提供することによって変性されるショウジョウバエ飼育のためのチューブ(すなわち、卵紙)1、2、6、7。このような方法は、比較的大きな空間(例えば、30cm x 30cm x 10cm:最大100ショウジョウバエチューブのW x Lx H)と、卵を数え、幼虫を孵化させる個々の卵紙の操作を必要とし、労働集約的であり得る。この原稿は、蚊の卵を数え、これらの問題を回避するために卵位表面として24のウェルプレートとアガロースを使用してハッチ率を決定する方法を提示します 8.
同時に、イオシノら9 は、個々の雌から得られた卵の計数を行うために12および24のウェルプレートを用いた詳細な方法を説明した。彼らのプロトコルは、時間と空間9を節約する従来の方法から大幅な改善を表した。しかし、彼らが説明したプロトコルは、卵がしばしば下または折り畳みで見つかるので、カウントを得るために個々の紙を展開する必要がある排卵の表面としてウェットフィルターペーパーを使用し続けています。彼らのプロトコルには、イメージング技術の使用や幼虫計数の方法も含まれなかった。
提示された、卵の数(すなわち、胎児性)および孵化率(すなわち、生殖能力)をAe.aegyptiの24ウェル組織培養プレートフォーマットでオビジポジション表面として使用する、適合性アッセイを行う改良された方法である。これらのプレートは、Egg、アガローズ、およびLアルバから「EAgaL」プレートと名付けられました。 これらの24のウェルプレートは、卵を産むために最小限の表面を個々の蚊に提供し、卵と孵化した幼虫を数日間数え、維持するために必要な時間と労力を簡素化し、大幅に削減します。EAgaLプレートは、卵の紙を扱い、孵化したときに卵と幼虫を見つける必要がなくなる卵の表面に半透明のアガロースを使用しています。各井戸を撮影すると、結果の長期アーカイブ記録が確立され、時間と空間の両方でカウントプロセスが、時間が限られているリアリング/ハンドリングプロセスから分離されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
EAgaLプレートは、FT法と比較して Aedes aegypti で個々の胎児性および生殖能力アッセイを行う労力、時間、および空間を大幅に削減します。FT法とEAgaLプレートとの間の予備比較は、すべてのステップに対して短い時間をもたらした(撮像技術はFT法に適用された)(表1)。参考として、起動およびアッセイ当たりの推定値(1つの24ウェルEAgaLプレート対24 FT)コストを 表2<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、テキサスA&Mアグリライフ研究昆虫ベクター病助成プログラムに資金を提供してくれたことに感謝します。また、この方法の開発に役立ち、原稿を作成する際の提案に関するAdelmanラボのメンバー、およびケビン・マイルズのラボメンバーに感謝します。また、この原稿をより良くするために、レビュアーや編集者の助けに感謝します。
Materials
| 1.6 mm Φ drill bit | alternatively heated nails can be used | ||
| 1000 μL pipette tips (long) | Olympus plastics | 24-165RL | |
| 24-well tissue culture plate | Thermo Scientific | 930186 | clear, flat-bottom with ringed lid plates |
| Agarose | VWR | 0710-500G | |
| Compact digital camera | Olympus | TG-5/TG-6 | |
| Computer (Windows, Mac or Linux) | |||
| Deionized water | |||
| Fiji (imageJ) software | download from: https://fiji.sc/ | ||
| Forceps | Dumont | sharp forceps may break mosquito's body | |
| Glass Petri dishes | VWR | ||
| Household bleach | |||
| Household electric drill | |||
| illuminator for stereomicroscope (gooseneck) | |||
| P-1000 pipette | Gilson | ||
| paint brushes | |||
| Rubber bands | |||
| SD card | to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better) | ||
| Spreadsheet software (Microsoft Excel) | Microsoft | Any spreadsheet software works | |
| TetraMin fish food | Tetra | ground with coffee grinder, blender or morter & pestle | |
| Transfer pipetts | VWR | 16011-188 |
References
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