Forbedret fecundity og ufrivillig analyse for Aedes aegypti ved hjelp av 24 Brønn vev kulturplater (EAgaL plater)
Summary
Beskrevet er en tids- og plassbesparende metode for å telle egg og bestemme lukehastigheten til individuelle mygg ved hjelp av 24 brønnvevskulturplater, noe som kan øke omfanget og hastigheten på fecundity og fruktbarhetsanalyser betydelig.
Abstract
Mygg representerer et betydelig folkehelseproblem som vektorer av ulike patogener. For de studiene som krever en vurdering av mygg fitness parametere, spesielt egg produksjon og luke priser på individnivå, konvensjonelle metoder har lagt en betydelig byrde på etterforskere på grunn av høy arbeidsintensitet og laboratorieplass krav. Beskrevet er en enkel metode ved hjelp av 24 brønnvevskulturplate med agarose i hver brønn og digital avbildning av hver brønn for å bestemme eggtall og lukehastigheter på individnivå med betydelig reduserte tids- og plassbehov.
Introduction
Kontrollen av mygg for å beskytte mennesker mot vektorbårne patogener er et viktig folkehelsemål, hovedsakelig på grunn av mangel på effektive vaksiner for de fleste patogener som bæres av mygg. Mange studier tar sikte på å redusere mygg fitness i forbindelse med en felt-gjeldende befolkningsreduksjon strategi1,2,3. Dette inkluderer omfattende studier for å lage transgene mygg og / eller CRISPR / Cas9 knockout linjer. Slike befolkningsmodifikasjonsmetoder krever en detaljert vurdering av individuelle treningsparametere4. Konvensjonelle laboratorieteknikker for å vurdere kondisjon av kvinnelige mygg inkluderer den individuelle inneslutningen av parret, blodmatet kvinnelige mygg i 100 ml beholdere5,modifiserte 50 ml koniske rør eller rør for Drosophila oppdrett modifisert ved å gi fuktige overflater ved hjelp av fuktig bomull og filterpapirplater for oviposisjon (dvs. eggpapir)1,2,6,7. Slike metoder krever en relativt stor plass (f.eks. 30 cm x 30 cm x 10 cm: B x L x H i opptil 100 Drosophila-rør) (Figur 1), og manipulering av individuelle eggpapir for å telle egg og klekkelarver, noe som kan være arbeidskrevende. Dette manuskriptet presenterer en metode for å telle myggegg og bestemme lukehastigheter ved hjelp av 24 brønnplater og agarose som en oviposisjonsoverflate for å omgå disse problemene8.
Samtidig beskrev Ioshino et al.9 en detaljert metode ved hjelp av 12 og 24 brønnplater for å utføre eggtelling oppnådd fra individuelle kvinner. Deres protokoll representerte en betydelig forbedring fra konvensjonelle metoder for å spare tid og plass9. Protokollen de beskrev fortsetter imidlertid å bruke vått filterpapir som en overflate for oviposisjon, noe som krever utfoldelse av hvert enkelt papir for å få tellinger, da egg ofte finnes under eller i bretter. Deres protokoll omfattet heller ikke bruk av bildeteknologier eller en metode for larvaltelling.
Presentert er en forbedret metode for å utføre treningsanalyser for eggnummer (dvs. fecundity) og lukehastighet (dvs. fruktbarhet) ved hjelp av agarose som en oviposisjonsoverflate i et 24 brønnvevskulturplateformat for Ae. aegypti som oviposit på fuktige overflater. Disse platene fikk navnet “EAgaL” plater, fra Egg, Agarose og Larva. Disse 24 brønnplatene gir individuelle mygg en minimal overflate for å legge egg, og dermed forenkle og drastisk redusere tiden og innsatsen som trengs for å telle og vedlikeholde egg og klekkede larver i noen dager. EAgaL-platen bruker gjennomskinnelig agarose for oviposisjonsoverflaten, noe som eliminerer behovet for å håndtere eggpapir og finne egg og larver når de klekkes; fotografering av hver brønn etablerer en langsiktig arkivert oversikt over resultatene og skiller telleprosessen i både tid og rom fra oppdretts-/håndteringsprosessen, der tiden ofte er begrenset.
Protocol
Representative Results
Discussion
EAgaL-platen reduserer drastisk arbeidskraft, tid og rom for å utføre individuelle fecundity og fruktbarhetsanalyser i Aedes aegypti sammenlignet med FT-metoden. Foreløpig sammenligning mellom FT-metoden og EAgaL-platen resulterte i kortere tider for alle trinn (bildeteknikk ble brukt på FT-metoden) (Tabell 1). Som referanse er det gitt et estimat på oppstart og per analyse (en 24 brønn EAgaL plate versus 24 FTs) kostnader i tabell 2.
D…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Texas A&M Agrilife Research Insect Vectored Diseases Grant Program for finansiering. Vi takker også Adelman lab-medlemmene for hjelp til å utvikle denne metoden og forslag når de utarbeider manuskriptet, samt Kevin Myles labmedlemmer. Vi takker også anmeldere og redaktører for deres hjelp til å gjøre dette manuskriptet bedre.
Materials
| 1.6 mm Φ drill bit | alternatively heated nails can be used | ||
| 1000 μL pipette tips (long) | Olympus plastics | 24-165RL | |
| 24-well tissue culture plate | Thermo Scientific | 930186 | clear, flat-bottom with ringed lid plates |
| Agarose | VWR | 0710-500G | |
| Compact digital camera | Olympus | TG-5/TG-6 | |
| Computer (Windows, Mac or Linux) | |||
| Deionized water | |||
| Fiji (imageJ) software | download from: https://fiji.sc/ | ||
| Forceps | Dumont | sharp forceps may break mosquito's body | |
| Glass Petri dishes | VWR | ||
| Household bleach | |||
| Household electric drill | |||
| illuminator for stereomicroscope (gooseneck) | |||
| P-1000 pipette | Gilson | ||
| paint brushes | |||
| Rubber bands | |||
| SD card | to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better) | ||
| Spreadsheet software (Microsoft Excel) | Microsoft | Any spreadsheet software works | |
| TetraMin fish food | Tetra | ground with coffee grinder, blender or morter & pestle | |
| Transfer pipetts | VWR | 16011-188 |
References
- Bond, J. G., et al. Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program. PLoS One. 14 (2), 0212520 (2019).
- Fernandes, K. M., et al. Aedes aegypti larvae treated with spinosad produce adults with damaged midgut and reduced fecundity. Chemosphere. 221, 464-470 (2019).
- Inocente, E. A., et al. Insecticidal and Antifeedant Activities of Malagasy Medicinal Plant (Cinnamosma sp.) Extracts and Drimane-Type Sesquiterpenes against Aedes aegypti Mosquitoes. Insects. 10 (11), 373 (2019).
- Marrelli, M. T., Moreira, C. K., Kelly, D., Alphey, L., Jacobs-Lorena, M. Mosquito transgenesis: what is the fitness cost. Trends in Parasitology. 22 (5), 197-202 (2006).
- da Silva Costa, G., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. Toward a blood-free diet for Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. , 217 (2019).
- Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti. PeerJ. 3, 938 (2015).
- Gonzales, K. K., et al. The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement, on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota. Scientific Reports. 8 (1), 11023 (2018).
- Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of Candidate Iron Transporters From the ZIP/ZnT Gene Families in the Mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
- Ioshino, R. S., et al. Oviplate: A Convenient and Space-Saving Method to Perform Individual Oviposition Assays in Aedes aegypti. Insects. 9 (3), 103 (2018).
- Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti. Parasites & Vectors. 8, 252 (2015).
- Valerio, L., Matilda Collins, C., Lees, R. S., Benedict, M. Q. Benchmarking vector arthropod culture: an example using the African malaria mosquito, Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae). Malaria Journal. 15 (1), 262 (2016).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
