Descrito é um método de economia de tempo e espaço para contar ovos e determinar as taxas de escotilha de mosquitos individuais usando 24 placas de cultura de tecido de poço, o que pode aumentar substancialmente a escala e a velocidade dos ensaios de fecundidade e fertilidade.
Os mosquitos representam um problema significativo de saúde pública como vetores de vários patógenos. Para aqueles estudos que exigem uma avaliação dos parâmetros de aptidão do mosquito, em particular a produção de ovos e as taxas de escotilha no nível individual, os métodos convencionais têm colocado uma carga substancial sobre os pesquisadores devido à alta intensidade de trabalho e aos requisitos de espaço laboratorial. Descrito é um método simples usando 24 placas de cultura de tecido de poço com agarose em cada poço e imagem digital de cada poço para determinar números de ovos e taxas de escotilha em um nível individual com requisitos de tempo e espaço substancialmente reduzidos.
O controle de mosquitos para proteger os humanos de patógenos transportados por vetores é um importante objetivo de saúde pública, principalmente devido à falta de vacinas eficazes para a maioria dos patógenos transportados por mosquitos. Muitos estudos visam reduzir o condicionamento físico do mosquito em conjunto com uma estratégia de redução populacional aplicável em campo1,2,3. Isso inclui estudos extensivos para criar mosquitos transgênicos e/ou linhas de nocaute CRISPR/Cas9. Tais abordagens de modificação populacional requerem uma avaliação detalhada dos parâmetros de aptidão individual4. Técnicas laboratoriais convencionais para avaliar a aptidão dos mosquitos fêmeas incluem a contenção individual de mosquitos fêmeas acasaladas e alimentadas pelo sangue em recipientes de 100 mL5,tubos consíquicos modificados de 50 mL ou tubos para criação de Drosophila modificados fornecendo superfícies úmidas usando papel de algodão úmido e filtro para oviposição (ou seja, papéis de ovo)1,2,6,7. Tais métodos requerem um espaço relativamente grande (por exemplo, 30 cm x 30 cm x 10 cm: W x L x H para até 100 tubos de Drosophila) (Figura 1), e a manipulação de papéis individuais de ovos para contagem de ovos e larvas de eclosão, que podem ser trabalhosas intensivas. Este manuscrito apresenta um método para contar ovos de mosquito e determinar as taxas de escotilha usando 24 placas de poço e surgiu como uma superfície de oviposição para contornar essas questões8.
Simultaneamente, Ioshino et al.9 descreveram um método detalhado usando 12 e 24 placas de poço para realizar a contagem de óvulos obtidas de fêmeas individuais. Seu protocolo representou uma melhoria significativa dos métodos convencionais na economia de tempo e espaço9. No entanto, o protocolo que eles descreveram continua a usar papel filtro molhado como uma superfície para oviposição, o que requer o desdobramento de cada papel individual para obter contagem, pois os ovos são frequentemente encontrados por baixo ou em dobras. Seu protocolo também não incluía o uso de tecnologias de imagem ou um método para contagem de larvas.
Apresentado é um método aprimorado para realizar ensaios de aptidão para o número de óvulos (ou seja, fecundidade) e taxa de escotilha (ou seja, fertilidade) usando agarose como superfície oviposition em um formato de placa de cultura de tecido de 24 poços para Ae. aegypti que oviposit em superfícies úmidas. Estas placas foram nomeadas placas “EAgaL”, de Egg, Agarose, e Larva. Essas 24 placas de poço fornecem aos mosquitos individuais uma superfície mínima para colocar ovos, simplificando e reduzindo drasticamente o tempo e esforço necessários para contar e manter ovos e larvas eclodidas por alguns dias. A placa EAgaL usa agarose translúcida para a superfície de oviposition, o que elimina a necessidade de manusear papéis de ovo e encontrar os ovos e larvas quando eclodido; fotografar cada poço estabelece um registro arquivado de longo prazo dos resultados e separa o processo de contagem em tempo e espaço do processo de criação/manuseio, onde o tempo é muitas vezes limitado.
A placa EAgaL reduz drasticamente o trabalho, o tempo e o espaço para realizar ensaios individuais de fecundidade e fertilidade no Aedes aegypti quando comparado com o método FT. A comparação preliminar entre o método FT e a placa EAgaL resultou em tempos mais curtos para todas as etapas (a técnica de imagem foi aplicada ao método FT) (Tabela 1). Como referência, uma estimativa de inicialização e por ensaio (uma placa EAgaL de 24 poços versus 24 FTs) são fornecidas na <stron…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos ao Programa de Subvenção de Doenças Vetoriadas de Insetos da Texas A&M Agrilife Research pelo financiamento. Agradecemos também aos membros do laboratório Adelman pela ajuda no desenvolvimento deste método e sugestões na elaboração do manuscrito, bem como aos membros do laboratório de Kevin Myles. Agradecemos também aos revisores e editores por sua ajuda para tornar este manuscrito melhor.
1.6 mm Φ drill bit | alternatively heated nails can be used | ||
1000 μL pipette tips (long) | Olympus plastics | 24-165RL | |
24-well tissue culture plate | Thermo Scientific | 930186 | clear, flat-bottom with ringed lid plates |
Agarose | VWR | 0710-500G | |
Compact digital camera | Olympus | TG-5/TG-6 | |
Computer (Windows, Mac or Linux) | |||
Deionized water | |||
Fiji (imageJ) software | download from: https://fiji.sc/ | ||
Forceps | Dumont | sharp forceps may break mosquito's body | |
Glass Petri dishes | VWR | ||
Household bleach | |||
Household electric drill | |||
illuminator for stereomicroscope (gooseneck) | |||
P-1000 pipette | Gilson | ||
paint brushes | |||
Rubber bands | |||
SD card | to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better) | ||
Spreadsheet software (Microsoft Excel) | Microsoft | Any spreadsheet software works | |
TetraMin fish food | Tetra | ground with coffee grinder, blender or morter & pestle | |
Transfer pipetts | VWR | 16011-188 |