Ensaio melhorado de fecundidade e fertilidade para a Aedes aegypti usando 24 placas de cultura de tecido poço (placas EAgaL)
Summary
Descrito é um método de economia de tempo e espaço para contar ovos e determinar as taxas de escotilha de mosquitos individuais usando 24 placas de cultura de tecido de poço, o que pode aumentar substancialmente a escala e a velocidade dos ensaios de fecundidade e fertilidade.
Abstract
Os mosquitos representam um problema significativo de saúde pública como vetores de vários patógenos. Para aqueles estudos que exigem uma avaliação dos parâmetros de aptidão do mosquito, em particular a produção de ovos e as taxas de escotilha no nível individual, os métodos convencionais têm colocado uma carga substancial sobre os pesquisadores devido à alta intensidade de trabalho e aos requisitos de espaço laboratorial. Descrito é um método simples usando 24 placas de cultura de tecido de poço com agarose em cada poço e imagem digital de cada poço para determinar números de ovos e taxas de escotilha em um nível individual com requisitos de tempo e espaço substancialmente reduzidos.
Introduction
O controle de mosquitos para proteger os humanos de patógenos transportados por vetores é um importante objetivo de saúde pública, principalmente devido à falta de vacinas eficazes para a maioria dos patógenos transportados por mosquitos. Muitos estudos visam reduzir o condicionamento físico do mosquito em conjunto com uma estratégia de redução populacional aplicável em campo1,2,3. Isso inclui estudos extensivos para criar mosquitos transgênicos e/ou linhas de nocaute CRISPR/Cas9. Tais abordagens de modificação populacional requerem uma avaliação detalhada dos parâmetros de aptidão individual4. Técnicas laboratoriais convencionais para avaliar a aptidão dos mosquitos fêmeas incluem a contenção individual de mosquitos fêmeas acasaladas e alimentadas pelo sangue em recipientes de 100 mL5,tubos consíquicos modificados de 50 mL ou tubos para criação de Drosophila modificados fornecendo superfícies úmidas usando papel de algodão úmido e filtro para oviposição (ou seja, papéis de ovo)1,2,6,7. Tais métodos requerem um espaço relativamente grande (por exemplo, 30 cm x 30 cm x 10 cm: W x L x H para até 100 tubos de Drosophila) (Figura 1), e a manipulação de papéis individuais de ovos para contagem de ovos e larvas de eclosão, que podem ser trabalhosas intensivas. Este manuscrito apresenta um método para contar ovos de mosquito e determinar as taxas de escotilha usando 24 placas de poço e surgiu como uma superfície de oviposição para contornar essas questões8.
Simultaneamente, Ioshino et al.9 descreveram um método detalhado usando 12 e 24 placas de poço para realizar a contagem de óvulos obtidas de fêmeas individuais. Seu protocolo representou uma melhoria significativa dos métodos convencionais na economia de tempo e espaço9. No entanto, o protocolo que eles descreveram continua a usar papel filtro molhado como uma superfície para oviposição, o que requer o desdobramento de cada papel individual para obter contagem, pois os ovos são frequentemente encontrados por baixo ou em dobras. Seu protocolo também não incluía o uso de tecnologias de imagem ou um método para contagem de larvas.
Apresentado é um método aprimorado para realizar ensaios de aptidão para o número de óvulos (ou seja, fecundidade) e taxa de escotilha (ou seja, fertilidade) usando agarose como superfície oviposition em um formato de placa de cultura de tecido de 24 poços para Ae. aegypti que oviposit em superfícies úmidas. Estas placas foram nomeadas placas “EAgaL”, de Egg, Agarose, e Larva. Essas 24 placas de poço fornecem aos mosquitos individuais uma superfície mínima para colocar ovos, simplificando e reduzindo drasticamente o tempo e esforço necessários para contar e manter ovos e larvas eclodidas por alguns dias. A placa EAgaL usa agarose translúcida para a superfície de oviposition, o que elimina a necessidade de manusear papéis de ovo e encontrar os ovos e larvas quando eclodido; fotografar cada poço estabelece um registro arquivado de longo prazo dos resultados e separa o processo de contagem em tempo e espaço do processo de criação/manuseio, onde o tempo é muitas vezes limitado.
Protocol
Representative Results
Discussion
A placa EAgaL reduz drasticamente o trabalho, o tempo e o espaço para realizar ensaios individuais de fecundidade e fertilidade no Aedes aegypti quando comparado com o método FT. A comparação preliminar entre o método FT e a placa EAgaL resultou em tempos mais curtos para todas as etapas (a técnica de imagem foi aplicada ao método FT) (Tabela 1). Como referência, uma estimativa de inicialização e por ensaio (uma placa EAgaL de 24 poços versus 24 FTs) são fornecidas na <stron…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Programa de Subvenção de Doenças Vetoriadas de Insetos da Texas A&M Agrilife Research pelo financiamento. Agradecemos também aos membros do laboratório Adelman pela ajuda no desenvolvimento deste método e sugestões na elaboração do manuscrito, bem como aos membros do laboratório de Kevin Myles. Agradecemos também aos revisores e editores por sua ajuda para tornar este manuscrito melhor.
Materials
| 1.6 mm Φ drill bit | alternatively heated nails can be used | ||
| 1000 μL pipette tips (long) | Olympus plastics | 24-165RL | |
| 24-well tissue culture plate | Thermo Scientific | 930186 | clear, flat-bottom with ringed lid plates |
| Agarose | VWR | 0710-500G | |
| Compact digital camera | Olympus | TG-5/TG-6 | |
| Computer (Windows, Mac or Linux) | |||
| Deionized water | |||
| Fiji (imageJ) software | download from: https://fiji.sc/ | ||
| Forceps | Dumont | sharp forceps may break mosquito's body | |
| Glass Petri dishes | VWR | ||
| Household bleach | |||
| Household electric drill | |||
| illuminator for stereomicroscope (gooseneck) | |||
| P-1000 pipette | Gilson | ||
| paint brushes | |||
| Rubber bands | |||
| SD card | to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better) | ||
| Spreadsheet software (Microsoft Excel) | Microsoft | Any spreadsheet software works | |
| TetraMin fish food | Tetra | ground with coffee grinder, blender or morter & pestle | |
| Transfer pipetts | VWR | 16011-188 |
References
- Bond, J. G., et al. Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program. PLoS One. 14 (2), 0212520 (2019).
- Fernandes, K. M., et al. Aedes aegypti larvae treated with spinosad produce adults with damaged midgut and reduced fecundity. Chemosphere. 221, 464-470 (2019).
- Inocente, E. A., et al. Insecticidal and Antifeedant Activities of Malagasy Medicinal Plant (Cinnamosma sp.) Extracts and Drimane-Type Sesquiterpenes against Aedes aegypti Mosquitoes. Insects. 10 (11), 373 (2019).
- Marrelli, M. T., Moreira, C. K., Kelly, D., Alphey, L., Jacobs-Lorena, M. Mosquito transgenesis: what is the fitness cost. Trends in Parasitology. 22 (5), 197-202 (2006).
- da Silva Costa, G., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. Toward a blood-free diet for Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. , 217 (2019).
- Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti. PeerJ. 3, 938 (2015).
- Gonzales, K. K., et al. The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement, on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota. Scientific Reports. 8 (1), 11023 (2018).
- Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of Candidate Iron Transporters From the ZIP/ZnT Gene Families in the Mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
- Ioshino, R. S., et al. Oviplate: A Convenient and Space-Saving Method to Perform Individual Oviposition Assays in Aedes aegypti. Insects. 9 (3), 103 (2018).
- Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti. Parasites & Vectors. 8, 252 (2015).
- Valerio, L., Matilda Collins, C., Lees, R. S., Benedict, M. Q. Benchmarking vector arthropod culture: an example using the African malaria mosquito, Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae). Malaria Journal. 15 (1), 262 (2016).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
