Улучшенная fecundity и анализ плодородности для Aedes aegypti используя 24 плит культуры ткани наилучшим образом (плиты EAgaL)
Summary
Описанный метод экономии времени и пространства для подсчета яйцеклеток и определения скорости вылупления отдельных комаров с использованием 24 пластин культуры тканей, которые могут существенно увеличить масштаб и скорость анализа плодовитости и фертильности.
Abstract
Комары представляют собой значительную проблему общественного здравоохранения в качестве переносчиков различных патогенов. Для тех исследований, которые требуют оценки параметров пригодности комаров, в частности производства яиц и скорости вылупления на индивидуальном уровне, традиционные методы несут существенную нагрузку на исследователей из-за высокой интенсивности труда и требований к лабораторным помещениям. Описанный простой метод, используя 24 хорошо ткани культуры пластины с агарозой в каждой хорошо и цифровой визуализации каждой хорошо, чтобы определить яйца номера и люк ставки на индивидуальном уровне с существенно сокращенным временем и пространством требования.
Introduction
Борьба с комарами для защиты человека от переносных патогенов является важной целью общественного здравоохранения, главным образом из-за отсутствия эффективных вакцин для большинства патогенных микроорганизмов, переносимых комарами. Многие исследования направлены на снижение пригодности комаров в сочетании с полевой применимой стратегиейсокращения популяции 1,2,3. Это включает в себя обширные исследования для создания трансгенных комаров и / или CRISPR / Cas9 нокаут линий. Такие подходы к модификации популяции требуют детальной оценки индивидуальных параметровпригодности 4. Обычные лабораторные методы для оценки пригодности самок комаров включает в себя индивидуальное сдерживание мякотных, сытых кровью самок комаров в 100 млконтейнеров 5, модифицированных 50 мл конических трубок, или трубки для Дрозофила выращивания модифицированных путем предоставления влажных поверхностей с использованием влажного хлопка и фильтра бумажных дисков для овипозиции (т.е. яйцеклетки)1,2,6,7. Такие методы требуют относительно большого пространства (например, 30 см х 30 см х 10 см: W x L x H для до 100 трубок дрозофилы) (рисунок 1), а также манипуляцииотдельными яичными бумагами для подсчета яиц и вылупления личинок, которые могут быть трудоемкими. Эта рукопись представляет собой метод подсчета яиц комаров и определения ставки люков с использованием 24 пластин и агарозы в качестве поверхности овипозиции, чтобы обойти этивопросы 8.
Параллельно Ioshino et al. 9 описалподробный метод использования 12 и 24 пластин хорошо для выполнения подсчета яйцеклеток, полученных от отдельных женщин. Их протокол представляет собой значительное улучшение по сравнению с обычными методами в экономии времени ипространства 9. Тем не менее, протокол они описали продолжает использовать влажную фильтровальную бумагу в качестве поверхности для овипозиции, которая требует раскрытия каждой отдельной бумаги, чтобы получить рассчитывает, как яйца часто находятся под или в складках. Их протокол также не включает использование технологий визуализации или метода подсчета личинок.
Представлено улучшенный метод для выполнения фитнес-анализов на количество яйцеклеток (т.е. плодовитость) и скорость люка (т.е. плодородие), используя агарозу в качестве поверхности овипозиции в формате 24 хорошо ткани культуры пластины для Ae. aegypti, чтоoviposit на влажных поверхностях. Эти пластины были названы “EAgaL” пластины, от Egg, Ага розы,и Lарва. Эти 24 хорошо пластины обеспечивают отдельных комаров с минимальной поверхностью, чтобы отложить яйца, тем самым упрощая и резко сокращая время и усилия, необходимые для подсчета и поддержания яиц и вылупившихся личинок в течение нескольких дней. Пластина EAgaL использует полупрозрачную агарозу для поверхности овипозиции, что устраняет необходимость обработки яичных бумаг и нахождения яиц и личинок при вылуплении; фотографирование каждого хорошо устанавливает долгосрочную архивную запись результатов и отделяет процесс подсчета как во времени, так и в пространстве от процесса воспитания/обработки, где время часто ограничено.
Protocol
Representative Results
Discussion
Пластина EAgaL резко сокращает труд, время и пространство для проведения индивидуальных анализов плодовитости и фертильности в Aedes aegypti по сравнению с методом FT. Предварительное сравнение метода FT и пластины EAgaL привело к сокращению времени для всех этапов (техника визуализации …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Техас АЗМ Agrilife исследований насекомых векторных заболеваний Грант программы для финансирования. Мы также благодарим сотрудников лаборатории Адельмана за помощь в разработке этого метода и предложения при составлении рукописи, а также сотрудников лаборатории Кевина Майлза. Мы также благодарим рецензентов и редакторов за помощь в улучшении этой рукописи.
Materials
| 1.6 mm Φ drill bit | alternatively heated nails can be used | ||
| 1000 μL pipette tips (long) | Olympus plastics | 24-165RL | |
| 24-well tissue culture plate | Thermo Scientific | 930186 | clear, flat-bottom with ringed lid plates |
| Agarose | VWR | 0710-500G | |
| Compact digital camera | Olympus | TG-5/TG-6 | |
| Computer (Windows, Mac or Linux) | |||
| Deionized water | |||
| Fiji (imageJ) software | download from: https://fiji.sc/ | ||
| Forceps | Dumont | sharp forceps may break mosquito's body | |
| Glass Petri dishes | VWR | ||
| Household bleach | |||
| Household electric drill | |||
| illuminator for stereomicroscope (gooseneck) | |||
| P-1000 pipette | Gilson | ||
| paint brushes | |||
| Rubber bands | |||
| SD card | to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better) | ||
| Spreadsheet software (Microsoft Excel) | Microsoft | Any spreadsheet software works | |
| TetraMin fish food | Tetra | ground with coffee grinder, blender or morter & pestle | |
| Transfer pipetts | VWR | 16011-188 |
References
- Bond, J. G., et al. Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program. PLoS One. 14 (2), 0212520 (2019).
- Fernandes, K. M., et al. Aedes aegypti larvae treated with spinosad produce adults with damaged midgut and reduced fecundity. Chemosphere. 221, 464-470 (2019).
- Inocente, E. A., et al. Insecticidal and Antifeedant Activities of Malagasy Medicinal Plant (Cinnamosma sp.) Extracts and Drimane-Type Sesquiterpenes against Aedes aegypti Mosquitoes. Insects. 10 (11), 373 (2019).
- Marrelli, M. T., Moreira, C. K., Kelly, D., Alphey, L., Jacobs-Lorena, M. Mosquito transgenesis: what is the fitness cost. Trends in Parasitology. 22 (5), 197-202 (2006).
- da Silva Costa, G., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. Toward a blood-free diet for Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. , 217 (2019).
- Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti. PeerJ. 3, 938 (2015).
- Gonzales, K. K., et al. The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement, on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota. Scientific Reports. 8 (1), 11023 (2018).
- Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of Candidate Iron Transporters From the ZIP/ZnT Gene Families in the Mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
- Ioshino, R. S., et al. Oviplate: A Convenient and Space-Saving Method to Perform Individual Oviposition Assays in Aedes aegypti. Insects. 9 (3), 103 (2018).
- Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti. Parasites & Vectors. 8, 252 (2015).
- Valerio, L., Matilda Collins, C., Lees, R. S., Benedict, M. Q. Benchmarking vector arthropod culture: an example using the African malaria mosquito, Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae). Malaria Journal. 15 (1), 262 (2016).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
