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Biologie du développement

Moulage vasculaire des poumons de souris postnatales adultes et précoces pour l’imagerie micro-CT

Published: June 20, 2020
doi:
10.3791/61242
, , , , , , ,
1Translational Vascular Medicine Branch, National Heart Lung and Blood Institute,National Institutes of Health, 2Mouse Imaging Facility, National Institute of Neurological Disorders and Stroke,National Institutes of Health, 3Division of Pediatric Surgery, Department of Surgery,University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

Le but de cette technique est la visualisation ex vivo des réseaux artériels pulmonaires des souris postnatales et adultes précoces par l’inflation pulmonaire et l’injection d’un composé à base de polymère radio-opaque par l’intermédiaire de l’artère pulmonaire. Les applications potentielles pour les tissus moulés sont également discutées.

Abstract

Les vaisseaux sanguins forment des réseaux complexes dans l’espace tridimensionnel. Par conséquent, il est difficile d’apprécier visuellement comment les réseaux vasculaires interagissent et se comportent en observant la surface d’un tissu. Cette méthode fournit un moyen de visualiser l’architecture vasculaire tridimensionnelle complexe du poumon.

Pour ce faire, un cathéter est inséré dans l’artère pulmonaire et la vascularisation est simultanément rincée de sang et chimiquement dilatée pour limiter la résistance. Les poumons sont ensuite gonflés par la trachée à une pression standard et le composé polymère est infusé dans le lit vasculaire à un débit standard. Une fois que l’ensemble du réseau artériel est rempli et autorisé à guérir, la vascularisation pulmonaire peut être visualisée directement ou image sur un scanner micro-CT (μCT).

Lorsqu’on les effectue avec succès, on peut apprécier le réseau artériel pulmonaire chez des souris allant de l’âge postnatal précoce aux adultes. En outre, bien que démontré dans le lit artériel pulmonaire, cette méthode peut être appliquée à n’importe quel lit vasculaire avec le placement optimisé de cathéter et les extrémités.

Introduction

L’objectif de cette technique est la visualisation de l’architecture artérielle pulmonaire à l’aide d’un composé à base de polymère chez la souris. Tandis que des travaux étendus ont été exécutés sur les lits vasculaires systémiques tels que le cerveau, le coeur, et le rein1,2,3,4,,5, moins d’information est disponible concernant la préparation et le remplissage du réseau artériel pulmonaire. Le but de cette étude, par conséquent, est d’élargir les travaux précédents6,7,8 et de fournir une référence écrite et visuelle détaillée que les chercheurs peuvent facilement suivre pour produire des images à haute résolution de l’arbre artériel pulmonaire.

Bien qu’il existe de nombreuses méthodes d’étiquetage et d’imagerie de la vascularisation pulmonaire, telles que l’imagerie par résonance magnétique, l’échocardiographie ou l’angiographiect 9,,10,bon nombre de ces modalités ne remplissent pas adéquatement et/ou capturent les petits vaisseaux, limitant ainsi la portée de ce qui peut être étudié. Les méthodes telles que le sectionnage en série et la reconstruction fournissent une haute résolution, mais sont temps / travail intensif11,12,13. L’intégrité des tissus mous environnants est compromise dans le moulage traditionnel de corrosion10,13,14,15,16. Même l’âge et la taille de l’animal deviennent des facteurs lors de la tentative d’introduire un cathéter ou, la résolution fait défaut. La technique d’injection de polymère, d’autre part, remplit les artères au niveau capillaire et lorsqu’elle est combinée avec μCT, permet une résolution inégalée5. Des échantillons de poumons de souris aussi jeunes que le jour postnatal 14 ont été lancés avec succès8 et traités en quelques heures. Ceux-ci peuvent être rescanned indéfiniment, ou même envoyé pour la préparation histologique / microscopie électronique (EM) sans compromettre le tissu mou existant17. Les principales limites à cette méthode sont le coût initial de l’équipement/logiciel de CT, les défis avec la surveillance précise de la pression intravasculaire, et l’incapacité d’acquérir des données longitudinalement dans le même animal.

Cet article s’appuie sur les travaux existants pour optimiser davantage la technique d’injection d’artère pulmonaire et repousser les limites liées à l’âge/taille jusqu’au jour postnatal 1 (P1) pour produire des résultats frappants. Il est plus utile pour les équipes qui veulent étudier les réseaux vasculaires artériels. Par conséquent, nous fournissons de nouvelles directives pour le placement/stabilisation de cathéter, le contrôle accru sur le taux/volume de remplissage, et mettons en évidence les pièges notables pour le succès accru de coulée. Les moulages qui en résultent peuvent ensuite être utilisés pour la caractérisation future et l’analyse morphologique. Peut-être plus important encore, c’est la première démonstration visuelle, à notre connaissance, qui guide l’utilisateur à travers cette procédure complexe.

Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (ACUC) de l’Institut national des poumons et du sang cardiaques. 1. Préparation Injectez la souris intraperitoneally avec de l’héparine (1 unité/g de poids corporel de la souris) et laissez-la s’ambriculer pendant 2 min. Euthanasier l’animal dans une chambre CO2. Disposer la souris en position supination sur une planc…

Representative Results

Un casting réussi présentera un remplissage uniforme de l’ensemble du réseau artériel pulmonaire. Nous le démontrons chez les souris C57Bl/6J dont l’âge est le cas : jour postnatal P90 (figure 4A),P30 (figure 4B), P7 (figure 4C)et P1 (figure 4D). En contrôlant le débit et en surveillant visuellement le remplissage en temps réel, des critères d’évaluation…

Discussion

Exécutée correctement, cette méthode donne des images saisissantes des réseaux artériels pulmonaires, permettant la comparaison et l’expérimentation dans les modèles de rongeurs. Plusieurs étapes critiques en cours de route assurent le succès. Tout d’abord, les chercheurs doivent hépariniser l’animal dans l’étape préparatoire pour empêcher les caillots sanguins de se former dans la vascularisation pulmonaire et les chambres du cœur. Cela permet le transit artériel complet du composé polymère. Deu…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette recherche a été appuyée en partie par le Programme de recherche intra-muros de la LNHBI (DIR HL-006247). Nous tenons à remercier le NIH Mouse Imaging Facility pour ses conseils en matière d’acquisition et d’analyse d’images.

Materials

1cc syringe Becton Dickinson 309659
20ml Glass Scintillation Vials Fisher 03-340-25P
30G Needle Becton Dickinson 305106
50mL conical tubes Cornin 352098 For sample Storage and scanning
60cc syringe Becton Dickinson 309653
7-0 silk suture Teleflex 103-S
Analyze 12.0 Software AnalyzeDirect Inc. N/A Primary Software
Amira 6.7 Software Thermo Scientific N/A Alternative Sofware
CeramaCut Scissors 9cm Fine Science tools 14958-09
Ceramic Coated Curved Forceps Fine Science tools 11272-50
CO2 Tank Robert's Oxygen Co. n/a
Dual syringe pump Cole Parmer EW-74900-10
Dumont Mini-Forceps Fine Science tools 11200-14
Ethanol Pharmco 111000200
Formalin Sigma – Life Sciences HT501128
Gauze Covidien 441215
Hemostat Fine Science tools 13013-14
Heparin (1000USP Units/ml) Hospira NDC 0409-2720-01
Horos Software Horos Project N/A Alternative Sofware
induction chamber n/a n/a
Kimwipe Fisher 06-666 fiber optic cleaning wipe
Labelling Tape Fisher 15966
Magnetic Base Kanetec N/A
Micro-CT system SkyScan  1172
Microfil (Polymer Compound) Flowech Inc. Kit B – MV-122 8 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent
Micromanipulator Stoelting 56131
Monoject 1/2 ml Insulin Syringe Covidien 1188528012
Octagon Forceps Straight Teeth Fine Science tools 11042-08
Parafilm Bemis company, Inc. #PM999
PE-10 tubing Instech BTPE-10
Phospahte buffered Saline BioRad #161-0780
Ring Stand Fisher S13747 Height 24in.
Sodium Nitroprusside sigma 71778-25G
Steel Plate N/A N/A 16 x 16 in. area, 1/16 in thick
Straight Spring Scissors Fine Science tools 15000-08
SURFLO 24G Teflon I.V. Catheter Santa Cruz Biotechnology 360103
Surgical Board Fisher 12-587-20 This is a converted slide holder
Universal 3-prong clamp Fisher S24280
Winged Inf. Set 25X3/4, 12" Tubing Nipro PR25G19
Zeiss Stemi-508 Dissection Scope Zeiss n/a
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Citer Cet Article
Knutsen, R. H., Gober, L. M., Sukinik, J. R., Donahue, D. R., Kronquist, E. K., Levin, M. D., McLean, S. E., Kozel, B. A. Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging. J. Vis. Exp. (160), e61242, doi:10.3791/61242 (2020).
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