Cultura de Pericytes Capilares Cerebrais para Medições citosóicas de cálcio e estudos de imagem de cálcio

Summary

Pericytes capilares cerebrais são atores essenciais na regulação das propriedades da barreira hemencefálica e do fluxo sanguíneo. Este protocolo descreve como pericytos capilares cerebrais podem ser isolados, cultivados, caracterizados em relação ao tipo celular e aplicados para investigações de sinalização intracelular de cálcio com sondas fluorescentes.

Abstract

Os pericítos estão associados com células endoteliais e pés de extremidade astrócito em uma estrutura conhecida como unidade neurovascular (NVU). A função de pericyte capilar cerebral não é totalmente conhecida. Os pericítos têm sido sugeridos para estarem envolvidos no desenvolvimento capilar, regulação do aperto da barreira endotelial e da atividade de trancostose, regulação do tom capilar e para desempenhar papéis cruciais em certas patologias cerebrais.

Os pericítos são desafiadores para investigar no cérebro intacto devido às dificuldades em visualizar processos no parenchyma cerebral, bem como a proximidade com as outras células da NVU. O presente protocolo descreve um método de isolamento e cultura de pericytes capilares cerebrais bovinos primários e seu uso seguinte em estudos de imagem de cálcio, onde os efeitos de agonistas envolvidos na sinalização cerebral e patologias podem ser investigados. Fragmentos capilares corticais são permitidos a anexar-se ao fundo dos frascos de cultura e, após 6 dias, células endoteliais e pericítos cresceram a partir dos fragmentos capilares. As células endoteliais são removidas por trippsinização suave e os pericítos são cultivados por 5 dias adicionais antes da passagem.

Pericítos isolados são semeados em placas de cultura de 96 poços e carregados com o corante indicador de cálcio (Fura-2 acetoximethyl (AM)) para permitir medidas de níveis intracelulares de cálcio em uma configuração de leitor de placas. Alternativamente, os pericílitos são semeados em tampas e montados em câmaras de células. Após o carregamento com o indicador de cálcio (Cal-520 AM), a imagem viva de cálcio pode ser realizada usando microscopia confocal em um comprimento de onda de excitação de 488 nm e comprimento de onda de emissão de 510-520 nm.

O método descrito aqui tem sido usado para obter as primeiras medidas intracelulares de cálcio a partir de pericytes capilares cerebrais primários, demonstrando que os pericítos são estimulados via ATP e são capazes de contrair in vitro.

Introduction

Pericytes capilares cerebrais, juntamente com células endoteliais e astrócitos, constituem a NVU^1,2,3. As células endoteliais, que formam a base estrutural dos capilares, formam tubos cilíndricos longos com diâmetro de 5-8 μm. As células endoteliais são esporadicamente cobertas com pericitos e cercadas por saliências de astrócitos; o astrócito endfee.

A barreira hemencefálica (BBB), situada nos capilares cerebrais, é o principal local de troca de nutrientes, gases e resíduos entre o cérebro e o sangue. O BBB também protege o cérebro de neurotoxinas endógenas e exógenas e serve como uma barreira para a entrega de um grande número de compostos medicamentosos. A função barreira é uma área de foco, bem como um obstáculo, para as empresas farmacêuticas que desenvolvem medicamentos do Sistema Nervoso Central (SNC). Isso estimulou um grande interesse em investigar as células da NVU na cultura⁴. Astrócitos cerebrais e células endoteliais foram cultivados e caracterizados em uma série de estudos, enquanto os estudos e protocolos para a cultura pericíte são escassos.

Protocolos publicados anteriormente descreveram a geração de culturas de pericíte capilares cerebrais até certo ponto, usando uma gama de diferentes abordagens, como imunopanning^5,mídia de alta e baixa glicose^6,classificação celular ativada por fluorescentes^7,centrifugação gradiente de densidade^8,etc. Embora esses métodos pareçam suficientes para obter culturas de pericítos, alguns são demorados, custam caro e os pericítos obtidos podem não ser ideais devido ao número de passagens culturais que podem deseleg diferenciar os pericítes⁹. Além disso, o potencial de pericítos cultivados em estudos de sinalização in vitro tem sido bastante inexplorado até agora.

O presente trabalho se concentra na geração de culturas pericíte de capilares cerebrais bovinos isolados e na configuração subsequente para medições e estudos de imagem de alterações no cálcio intracelular, um importante mensageiro intracelular. Descrevemos brevemente o isolamento dos capilares da matéria cinzenta cortical (para detalhes ver Helms et al.¹⁰) e o isolamento e cultura de pericílitos em monocultura pura sem contaminação com células endoteliais ou gliais. Em seguida, fornecemos um protocolo para semeadura de pericítos em placas de 96 poços e protocolos de carregamento para a sonda de cálcio Fura-2 AM. Finalmente, mostramos como os pericítos podem ser usados em imagens confocal em tempo real em câmaras de cultura de microscópio e descrevemos os protocolos para isso.

Protocol

1. Preparação de buffers e soluções para cultivo de células Prepare a solução de estoque de colágeno dissolvendo 5 mg de colágeno IV da placenta humana em 50 mL de PBS durante a noite a 4 °C. Aliquot a solução de estoque em porções de 5 mL e armazene a -20 °C. Prepare a solução de estoque de fibronectina dissolvendo 5 mg de fibronectina em 5 mL de água estéril durante a noite. Armazene os estoques de fibronectina em alíquotas de 500 μL a -20 °C. Ao descongelar, adicione PBS a u…

Representative Results

Capilares cerebrais bovinos foram isolados do tecido cerebral fresco e a Figura 1 apresenta a semeadura capilar e o crescimento celular ao longo dos dias e posterior purificação de pericítos. Os capilares estão totalmente ligados ao frasco no primeiro dia e no dia 2 o broto endotelial tornou-se visível(Figura 1, dia 2). Após 4 dias, o crescimento celular é altamente distinto(Figura 1, dia 4a) …

Discussion

Neste estudo, apresentamos um método para isolar pericítos primários de cérebros bovinos. O protocolo descrito permite a cultura desse tipo de célula bastante inacessível. A cultura celular posteriormente obtida foi uma população quase homogênea de pericítos, com pouca ou nenhuma contaminação com células endoteliais e células gliais baseadas na morfologia celular e expressão proteica¹². Além disso, demonstramos um método simples e simples para carregar os pericítos com corantes d…

Materials

ATP	Tocris	3245
Cal-520 AM	AAT Bioquest	21130
Cell incubator	Thermo Fisher
Centrifuge	Thermo Fisher	Heraeus Multifuge 3SR+	Standard large volume centrifuge for spinning down cells
Collagen IV	Sigma Aldrich	C5533
Confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss	Zeiss LSM 510	Inverted microscope
Counting chamber	FastRead	102
Coverslip cell chamber	Airekacells	SC15022
Cremophor EL	Sigma Aldrich	C5135	Formerly known as Kolliphor EL
DMSO	Sigma Aldrich	471267
Dulbecco's Modified Eagles Medium	Sigma Aldrich	D0819
Fetal bovine serum (FBS)	PAA/GE Healthcare	A15-101
Fibronectin	Sigma Aldrich	F1141
Fura-2 AM	Thermo Fisher	F1201
Glass coverslips 22×22 mm	VWR International	631-0123
HBSS	Gibco	14065-049
Heparin	Sigma Aldrich	H3149
HEPES	AppliChem Panreac	A1069
Light microscope	Olympus	Olympus CK2	Upright light microscope with phase contrast
MEM nonessential amino acids	Sigma Aldrich	M7145
Microplate Reader	BMG LabTech	NOVOstar
PBS	Sigma Aldrich	D8537	Phosphate-buffered saline
penicillin G sodium/streptomycin sulfate	Sigma Aldrich	P0781
Pluronic F127	Sigma Aldrich	P2443
Trypsin-EDTA	Sigma Aldrich	T4299
T-75 flask	Sigma Aldrich	CLS3972
96-well plate	Corning incorporated	3603