Målet med denne artikel er at give en standardiseret tilgang til at fremkalde human hepatisk stamfader differentiering fra pluripotente stamceller. Udviklingen af denne procedure med brugsklare medieformuleringer giver brugeren et letkøbt system til at generere menneskelige leverceller til biomedicinsk forskning og oversættelse.
Leversygdom er et eskalerende globalt sundhedsproblem. Mens levertransplantation er en effektiv form for terapi, patientdødelighed er steget på grund af mangel på donororgan tilgængelighed. Organknaphed påvirker også den rutinemæssige forsyning af menneskelige hepatocytter til grundforskning og klinikken. Derfor er udviklingen af vedvarende kilder til menneskelige lever stamfaderceller ønskelig og er målet med denne undersøgelse. For effektivt at kunne generere og implementere menneskelige leverformænd i stor skala blev der udviklet et reproducerbart leverforældreisystem. Denne protokol hjælper eksperimentel reproducerbarhed mellem brugere i en række cellekulturartikler formater og tillader differentiering ved hjælp af både, menneskelige embryonale og induceret pluripotente stamcellelinjer. Disse er vigtige fordele i forhold til de nuværende differentieringssystemer, der vil forbedre grundforskningen og bane vejen for klinisk produktudvikling.
Leversygdom udgør en global sundhedsudfordring, der forårsager ca. 2 millioner dødsfald om året på verdensplan1. Selv om der findes en række modelsystemer til at studere leversygdomme og gribe klinisk ind, er den rutinemæssige brug af cellebaserede systemer begrænset af betydelige ulemper (til en gennemgang se Szkolnicka et al.2). Avanceret human pluripotente stamcellekultur (hPSC) kultur og somatiske celledifferentieringsmetoder repræsenterer lovende teknologier til at udvikle værktøjer til grundlæggende biomedicinsk forskning og vedvarende kilder til differentierede celler til klinikken3,4.
Til dato er der udviklet flere protokoller for hepatocyt-lignende celledifferentiering (HLC)5,6,7,8. Disse protokoller forsøger at genskabe aspekter af menneskets leverudvikling ved hjælp af en kombination af små molekyler og vækstfaktorer9,10. De fleste protokoller består af en trinvis differentieringsproces, hvor hPSC’er er primet til endelig endoderm, efterfulgt af lever stamfaderspecifikation11,12,13og slutter med HLC-specifikation. HLCs produceret af disse protokoller viser en blanding af føtale og voksne fænotyper. Dette omfatter udtrykket af alfa fetoprotein (AFP), såsom hepatocyt markører såsom HNF4α og albumin (ALB), samt narkotika metaboliserende kapacitet14,15,16. Mellem laboratorierne kan HLC-differentiering variere. derfor er det nødvendigt at udvikle standardiserede protokoller. Dette vil gøre det muligt for forskere effektivt at generere og anvende stamcellebaserede HLCs i stor skala til grundforskning og klinisk forskning.
En lever stamfader differentiering system blev udviklet, der kan anvendes på både menneskelige embryonale og induceret pluripotente stamcellelinjer ved hjælp af let at følge retningslinjer. Denne procedure giver homogene populationer af lever stamfaderer i forskellige cultureware formater, lige fra celle kultur kolber til 96 brønd plader. Nedenfor er protokollen til fremstilling af stamcelle-afledte lever stamfaderer i 24 og 96 brøndformater.
Celletæthed, der anvendes i nedenstående protokol, er angivet for en brønd på henholdsvis 24 og 96 brøndplade (se tabel 1). Optimering af startcellenummeret er påkrævet for de forskellige cellekulturpladeformater og cellelinjer. Den foreslåede startcelletæthed til protokoloptimering er 2 x 105 celler/cm2. Til tæthedsoptimering kan flere celletætheder testes ved at tilføje ± 50.000 celler/cm2 ad gangen.
Generationen af menneskelige leverfaderceller fra pluripotente stamceller i stor skala kunne udgøre et lovende alternativ til kadaver-afledt materiale. Protokolstandardisering og reproducerbarhed er nøglen til at sikre teknologioversættelse og indvirkning på biomedicinsk forskning. For at løse dette har tidligere arbejde fokuseret på at udvikle en trinvis differentieringsprotokol fra hESC og iPSC’er ved hjælp af definerede tilsætningsstoffer og matricer15,23,24,25,26,27,28. Ved at gøre dette er hepatocyt fænotype og reproducerbarhed blevet forbedret, så semiautomatisering af differentieringsprocessen19. Det præsenterede system styrkes af dets kombination med off-the-shelf cellekulturmedier og et letkøbt hepatocytdifferentieringssystem.
Tidligere blev pluripotente celletæthed forud for starten af differentieringsprotokollen fremhævet som en nøglevariabel for at opnå en homogen population af lever stamfaderceller26. Ved hjælp af denne mere raffinerede procedure er det muligt at generere et stort antal stamcellebaserede leverformænd på en trinvis måde ved hjælp af en række startcelletætheder (tabel 1). På dag 5 blev endelig endoderm induktion valideret af Sox17 farvning (Figur 3). Der blev opnået en effektiv og robust differentiering i den endelige ende af 1980 med både testede ESC- og iPSC-linjer, idet mere end 80 % udtrykte Sox17 (figur 3). På dag 10, lever stamfaderer viste en ensartet brosten-lignende morfologi, og leveren stamcelle markører var højt beriget for både AFP og HNF4α (>86%, Figur 4). Ved hjælp af en kombination af manuelle og halvautomatiske teknologier var det muligt at udføre differentiering i flere pladeformater19.
I sin nuværende form er celledifferentiering velegnet til in vitro-baserede eksperimenter. Celleberigelse vil dog sandsynligvis være påkrævet før klinisk anvendelse for at sikre, at en homogen population af leverformænd er forberedt til levering.
Afslutningsvis giver den protokol, der er beskrevet her, feltet en standardiseret tilgang til fremstilling af leverformænd i stor skala. Det fremtidige arbejde vil fokusere på produktion af et nyt medium til efterfølgende HLC-differentiering, modning og vedligeholdelse.
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet med priser fra MRC Ph.d.-uddannelse Partnerskab (MR/K501293/1), uk Regenerative Medicine Platform (MRC MR/L022974/1 og MR/K026666/1), Chief Scientist Office (TCS/16/37).
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
Hoechst 33342 Ready Flow Reagent | thermofisher | R37165 | |
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
Human Serum Albumin ELISA | Alpha Diagnostics | 1190 | |
Human Serum Alpha Fetoprotein ELISA | Alpha Diagnostics | 500 | |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
Operetta High-Content Imaging System | PerkinElmer | HH12000000 | |
PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement CJ | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement MR | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Endoderm Basal Medium | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Hepatic Progenitor Medium | STEMCELL Technologies | ||
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Antibodies | |||
Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:200 (mouse) |
Alpha-fetoprotein | Sigma-Aldrich | A8452 | 1:400 (mouse) |
HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:400 (rabbit) |
IgG | DAKO | 1:400 | |
Sox17 | R&D Systems, Inc. | AF1924 | 1:200 (Goat) |
Software | |||
Columbus Image Data Storage and Analysis system | PerkinElmer |