뉴런의 세포 인신 매매 연구를 위한 튜브에서 정제하고 직접 모노 바이오티니레이트 BDNF를 정화하는 향상된 프로토콜
Summary
Avi 서열을 포함하는 재조합 BDNF(BDNFAvi)는 HEK293 세포에서 비용 효율적인 방식으로 생산되며 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. BDNFavi는 튜브에 효소 BirA와 직접 모노 바이오티니화된다. BDNFavi 및 모노 바이오타이니드 BDNFavi는 시판되는 BDNF와 비교하여 생물학적 활성을 유지합니다.
Abstract
Avi 서열을 포함하는 재조합 BDNF(BDNFAvi)는 HEK293 세포에서 생산된 다음 친화 성염색체에 의해 비용 효율적으로 정제된다. 재현 가능한 프로토콜은 튜브에 효소 BirA와 직접 모노 바이오티니레이트 BDNFAvi를 개발하였다. 이 반응에서, 모노 바이오티니화 BDNFAvi는 그것의 생물학 활동을 유지합니다.
Neurotrophins는 신경 발달 및 유지 보수에 있는 역할을 하는 표적 유래 성장 인자입니다. 그(것)들은 다른 신경 구획 사이 장거리 신호화를 허용하기 위하여 내분비 통로를 따라 급속한 수송 기계장치가 필요합니다. neurotrophins의 인신 매매를 연구하는 분자 공구의 발달은 생체 내 기록을 사용하여 세포에 있는 이 단백질의 정확한 추적을 가능하게 했습니다. 이 프로토콜에서는 모노 바이오타이니드 BDNF 생산을 위한 최적화되고 비용 효율적인 절차를 개발했습니다. 생체개능 avi 서열(BDNFAvi)을 함유한 재조합 BDNF 변종은 마이크로그램 범위의 HEK293 세포에서 생산된 다음 친화성 크로마토그래피를 사용하여 쉽게 확장 가능한 절차로 정제된다. 정제된 BDNF는 튜브내 효소 BirA와의 직접 체외 반응에 의해 균일하게 모노 바이오티니화될 수 있다. 모노 바이오타이니드 BDNF(mbtBDNF)의 생물학적 활성은 상이한 형광에 대한 연쇄상 구각에 공인될 수 있다. BDNFAvi 및 mbtBDNF는 각각 서부 얼룩을 사용하여 하류 인광 표적의 검출및 전사 인자 CREB의 활성화를 통해 입증된 생물학적 활성을 유지한다. 스트렙타비딘 양자점을 사용하여, 우리는 인계 CREB 특정 항체로 검출된 CREB의 활성화와 수반되는 mbtBDNF 내재화를 시각화할 수 있었습니다. 또한, mbtBDNF는 연쇄상 구균-양자점에 공주하여 미세유체 챔버에서 자란 피질 뉴런의 역행 운송 분석에 적합했다. 따라서, 튜브에서 생성된 mbtBDNF는 뉴런에서 생리적 신호 내역및 인신매매를 연구하는 신뢰할 수 있는 도구이다.
Introduction
뉴런은 시냅스 통신을 허용하는 복잡하고 전문적인 형태를 소유하는 신경계의 기능 단위이며, 따라서 다양한 자극에 대응하여 조정되고 복잡한 행동의 생성이다. 점선 및 축삭과 같은 신경 투영은 신경 통신에 관여하는 중요한 구조적 특징이며, neurotrophins는 그들의 형태와 기능1을결정하는 결정적인 선수입니다. Neurotrophins는 NGF, NT-3, NT-4 및 두뇌 유래 신경 영양인자 (BDNF)2를포함하는 분비성장 인자의 가족입니다. 중추신경계(CNS)에서 BDNF는 신경전달, 수지상 식소, 수지상 척추의 성숙, 장기 전능성 등 다양한 생물학적 과정에 참여한다3,,4. 따라서, BDNF는 신경 기능을 조절에 중요한 역할을 한다.
다양한 세포 프로세스는 BDNF 역학 및 기능을 조절합니다. 신경 표면에, BDNF는 tropomyosin 수용체 키나아제 B (TrkB) 및/또는 p75 neurotrophin 수용체 (p75)를 결합합니다. BDNF-TrkB 및 BDNF-p75 복합체는 내분비소로 분류되어 다른 내세포 세포기관5,,6,,7,,8에서분류된다. BDNF/TrkB 복합체의 정확한 세포내 인신 매매는 다른 뉴런회로9,,10,,11에서적절한 BDNF 신호에 필요합니다. 이러한 이유로, BDNF 인신 매매 역학의 깊은 이해와 병리학 적 과정에서 발견 되는 그것의 변경 은 건강 및 질병에 BDNF 신호를 이해 하는 데 필수적이다. 이 과정을 모니터링하는 신규 및 특정 분자 도구의 개발은이 분야를 앞으로 추진하고 관련된 규제 메커니즘을 더 잘 파악하는 데 도움이 될 것입니다.
뉴런에서 BDNF 인신 매매의 연구에 사용할 수있는 몇 가지 도구가 있습니다. 일반적으로 사용되는 방법론은 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 GFP mCherry12,13의단황 형광 적변 변이체와 같은 형광 분자로 태그된 재조합 BDNF의전환과관련이 있다. 그러나, BDNF 과발현의 주요 단점은 이 neurotrophin의 알려진된 농도를 전달의 가능성을 제거 한다는 것입니다. 또한, 세포 독성이 발생할 수 있으며,결과(14)의해석을 모호하게 할 수 있다. 대체 전략은 플래그-TrkB와 같은 에피토프 태그가 지정된 TrkB의 전환입니다. 이 방법론은 TrkB 내재화 역학 의 연구를 허용15,하지만 그것은 또한 트랜스페션을 포함, 변경 된 TrkB 기능 및 세포 독성귀착될 수 있습니다. 이러한 방법론적 장애물을 극복하기 위해, 비틴-리게아제 효소 BirA에 의해 모노 바이오티닝될 수 있는 Avi 서열(BDNFAvi)을 함유하는 NGF 및 BDNF의 재조합 변이체가16,,17로개발되었다. 바이오타이니드 재조합 BDNF는 형광, 구슬, 파라자성 나노 입자를 포함하는 다른 스트렙타비딘 바운드 도구에 결합될 수 있다. 살아있는 세포 이미징의 관점에서, 양자점(QD)은 소분자형광호(18)에비해 광표백에 대한 밝기 및 저항증가와 같은 단일 입자 추적에 바람직한 특성을 가지므로 자주 사용되는 형광이 되고 있다.
BDNFAvi를 이용한 모노바이오티니얼BDNF(mbtBDNF)의 생산은 BDNFAvi와 BirA의 발현을 구동하는 플라스미드의 공동 변환에 의해 달성되었으며, 그 다음으로 20m2의 BDNF 의 수율1-2μg의 수율로 합산 단백질의 정제를달성하였다. 여기서는 조작의 용이성을 위해 크로마토그래피 컬럼 기반 프로토콜에서 단백질 회복을 극대화하고자 하는 HEK293 컨디셔닝 된 미디어의 500mL에서 BDNFAvi 정화를 허용하는 이 프로토콜의 수정을 제안합니다. 사용된 경피제인 폴리에틸렌네이민(PEI)은 경질 수율을 희생하지 않으면서 비용 효율적인 방법을 보장합니다. 모노 바이오타이니션 단계는 공동 트랜스페션과 관련된 합병증을 피하고 BDNF의 균일한 라벨링을 보장하기 위해 체외 반응에 적응되었습니다. mbtBDNF의 생물학적 활성은 마이크로 유체 챔버에서 BDNF의 역행 축축산 수송을 연구하기 위해 pCREB 및 라이브 세포 이미징의 활성화를 포함하여 서양 블롯 및 형광 현미경 실험에 의해 입증되었다. 이 프로토콜을 사용하면 균일한 모노 바이오티니화 및 생물학적 활성 BDNF의 최적화된 고수량 생산을 허용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 문서에서는, 친화도 크로마토그래피 기반 절차에서 mbtBDNF의 생산 및 정화를 위한 최적화된 방법론이 기술되고, 성 및협력자(17)의작업을 기반으로 한다. 최적화는 리포펙타민과 같은 더 비싼 형질 전환 방법의 효율성을 유지하면서 비용 효율적인 트랜스페트 시약 (PEI)의 사용을 포함한다. 이러한 최적화는 프로토콜의 상당한 비용 절감으로 이어지며 높은 비용 효율성을 유지?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 폰데시트 (1171137) (FCB), 과학 기술 우수 센터 (AFB 170005) (FCB), 밀레니엄 핵 (P07/011-F) (FCB), 웰컴 트러스트 수석 조사상 (107116/ Z/Z/ 15) 영국 연구소(107116/Z/Z)의 재정 지원을 감사하게 인정합니다. 이 작품은 Unidad 드 마이크로스코피아 아반자다 UC (UMA UC)에 의해 지원되었다.
Materials
| 2 way stopcock | BioRad | 7328102 | Chromatography apparatus component |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | BDNF elution buffer |
| Acrylamide/Bisacrylamide | BioRad | 1610154 | SDS-PAGE gel preparation |
| Amicon Ultra-15 10K | Millipore | UFC901024 | BDNF concentration |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A9164 | SDS-PAGE gel preparation |
| anti B-III-Tubulin antibody | Sigma | T8578 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti BDNF antibody | Alomone | AGP-021 | Western blot assays for BDNF quantification |
| anti BDNF antibody | Alomone | ANT-010 | Western blot assays for BDNF quantification |
| Anti ERK antibody | Cell Signaling | 9102 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pCREB antibody (S133) | Cell Signaling | 9198 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pERK antibody (T202, Y204) | Cell Signaling | 4370 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pTrkB antibody (Y515) | Abcam | ab109684 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-062 | HEK293 maintenance |
| ATP | Sigma | A26209 | BDNF monobiotinylation buffer |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | Neuron maintenance |
| Bicine | Sigma | B3876 | BDNF monobiotinylation buffer |
| BirA-GST | BPS Bioscience | 70031 | Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation |
| Bovine Fetal Serum | HyClone | HC.SH30396.02 | HEK293 maintenance |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence |
| D-Biotin | Sigma | B4639 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| DMEM High Glucose Medium | Gibco | 11965-092 | Neuron seeding |
| DMEM Medium | Gibco | 11995-081 | HEK293 maintenance |
| Econo Column Funnel | BioRad | 7310003 | Chromatography apparatus component |
| EDTA | Merck | 108418 | |
| EZ-ECL Kit | Biological Industries | 1633664 | Protein detection by western blotting |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Neuron and HEK293 maintenance |
| Glycerol | Merck | 104094 | BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays |
| Hettich Rotina 46R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for clearing the medium of debris |
| Hettich Universal 32R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for protein concentrator centrifugation |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Neuron seeding |
| ImageQuant LAS 500 | GE Healthcare Life Sciences | 29005063 | Western blot image acquisition |
| Imidazole | Sigma | I55513 | BDNF buffer modification component |
| KCl | Winkler | BM-1370 | PBS component |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | PBS component |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Luer Tubing Adaptor | BioRad | 7323245 | Chromatography apparatus component |
| Luminata™ Forte Western HRP Substrate | Millipore | WBLUF0100 | Protein detection by western blotting |
| Mg(CH3COO)2 | Merck | 105819 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | Mounting reagent for immunofluorescence assays |
| MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads | Invitrogen | 65001 | Biotinylation verification |
| Na2HPO4 | Merck | 106586 | BDNF buffer modification component |
| NaCl | Winkler | BM-1630 | PBS component, BDNF buffer modification component |
| NaH2PO4 | Merck | 106346 | BDNF buffer modification component |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Neuron maintenance |
| Ni-NTA Agarose Beads | Qiagen | 30210 | BDNF AviTag purification |
| Nikon Ti2-E | Nikon | Microscope for fluorescence imaging | |
| Nitrocellulose Membrane | BioRad | 1620115 | Protein transfer for western blotting |
| ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | Camera for epifluorescence imaging |
| P8340 Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | BDNF buffer modification component |
| Paraformaldehyde | Merck | 104005 | Fixative for immunofluorescence assays |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Neuron maintenance |
| Poli-D-Lysine | Corning | DLW354210 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Poli-L-Lysine | Millipore | P2363 | Cover coating for non-compartmentalized neurons |
| Poly-Prep Chromatography Column | BioRad | 7311550 | Chromatography apparatus component |
| Polyethyleneimine 25K | Polysciences Inc. | PLY-0296 | HEK293 transfection |
| Quantum Dots 655 streptavidin conjugate | Invitrogen | Q10121MP | Monobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments |
| Saponin | Sigma | S4521 | Detergent for immunofluorescence assays |
| Sucrose | Merck | 107687 | |
| Syldgard 184 silicone elastomer base | Poirot | 4019862 | Microfluidic chamber preparation |
| TEMED | Sigma | T9281 | SDS-PAGE gel preparation |
| Tris | Winkler | BM-2000 | Lysis buffer component |
| Triton X100 | Merck | 108603 | Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays |
| Trypsin-EDTA 0.5% | Gibco | 15400-054 | HEK293 passaging |
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