En forbedret protokoll for å rense og direkte mono-bio-biotinylate rekombinant BDNF i et rør for cellulære trafficking studier i nevroner
Summary
Rekombinant BDNF som inneholder en Avi-sekvens (BDNFAvi) produseres i HEK293-celler på en kostnadseffektiv måte og renses av affinitetkromatografi. BDNFavi blir deretter direkte mono-biotinylert med enzymet BirA i et rør. BDNFavi og mono-biotinylated BDNFavi beholder sin biologiske aktivitet sammenlignet med kommersielt tilgjengelig BDNF.
Abstract
Rekombinant BDNF som inneholder en Avi-sekvens (BDNFAvi) produseres i HEK293-celler og deretter kostnadseffektivt renset av affinitetkromatografi. En reproduserbar protokoll ble utviklet for å direkte mono-bio-tinylate BDNFAvi med enzymet BirA i et rør. I denne reaksjonen beholder mono-biotinylert BDNFAvi sin biologiske aktivitet.
Neurotrophins er målavledede vekstfaktorer som spiller en rolle i nevronal utvikling og vedlikehold. De krever raske transportmekanismer langs den endokytiske veien for å tillate langdistansesignal mellom forskjellige nevronale rom. Utviklingen av molekylære verktøy for å studere smugling av neurotrophins har gjort det mulig for nøyaktig sporing av disse proteinene i cellen ved hjelp av in vivo-opptak. I denne protokollen utviklet vi en optimalisert og kostnadseffektiv prosedyre for produksjon av mono-biotinylated BDNF. En rekombinant BDNF-variant som inneholder en biotinylable avi-sekvens (BDNFAvi) produseres i HEK293-celler i mikrogramområdet og deretter renses i en lett skalerbar prosedyre ved hjelp av affinitetkromatografi. Den rensede BDNF kan deretter homogent være mono-biotinylated av en direkte in vitro reaksjon med enzymet BirA i et rør. Den biologiske aktiviteten til den mono-biotinylated BDNF (mbtBDNF) kan konjugeres til streptavidin-konjugert til forskjellige fluorofofag. BDNFAvi og mbtBDNF beholder sin biologiske aktivitet demonstrert gjennom påvisning av nedstrøms fosforylerte mål ved hjelp av henholdsvis vestlig blot og aktivering av transkripsjonsfaktoren CREB. Ved hjelp av streptavidin-quantum prikker, var vi i stand til å visualisere mbtBDNF internalisering samtidig med aktivering av CREB, som ble oppdaget med et fosfo-CREB spesifikt antistoff. I tillegg var mbtBDNF konjugert til streptavidin-quantum prikker egnet for retrograd transportanalyse i kortikale nevroner dyrket i mikrofluidiske kamre. Dermed, i rør produsert mbtBDNF er et pålitelig verktøy for å studere fysiologisk signalisering endosome dynamikk og menneskehandel i nevroner.
Introduction
Nevroner er de funksjonelle enhetene i nervesystemet som har en kompleks og spesialisert morfologi som tillater synaptisk kommunikasjon, og dermed generering av koordinert og kompleks oppførsel som svar på ulike stimuli. Nevronale projeksjoner som dendritter og aksoner er kritiske strukturelle egenskaper involvert i nevronal kommunikasjon, og neurotrophins er avgjørende aktører i å bestemme deres morfologi og funksjon1. Neurotrophins er en familie av utskilte vekstfaktorer som inkluderer NGF, NT-3, NT-4, og hjerne-avledet nevrotrofisk faktor (BDNF)2. I sentralnervesystemet (CNS) deltar BDNF i ulike biologiske prosesser, inkludert nevrotransmisjon, dendrittisk arborisering, modning av dendrittiske spines, langsiktig potensering, blant annet3,4. Derfor spiller BDNF en kritisk rolle i å regulere nevronal funksjon.
Ulike cellulære prosesser regulerer BDNF-dynamikken og funksjonen. På den nevronale overflaten binder BDNF tropomyosinreseptorkinase B (TrkB) og/eller p75 neurotrophinreseptoren (p75). BDNF-TrkB og BDNF-p75 komplekser er endokytosed og sortert i forskjellige endokytiske organeller5,,6,,7,,8. Korrekt intracellulær smugling av BDNF/TrkB-komplekset er nødvendig for riktig BDNF-signalering i forskjellige nevronale kretser9,,10,,11. Av denne grunn er en dyp forståelse av BDNF trafficking dynamikk og dens endringer som finnes i patofysiologiske prosesser avgjørende for å forstå BDNF signalering i helse og sykdom. Utviklingen av nye og spesifikke molekylære verktøy for å overvåke denne prosessen vil bidra til å drive dette feltet fremover og tillate en bedre forståelse av de regulatoriske mekanismene som er involvert.
Det finnes flere verktøy tilgjengelig for studiet av BDNF smugling i nevroner. En vanlig metodikk innebærer transfeksjon av rekombinant BDNF merket med fluorescerende molekyler som grønt fluorescerende protein (GFP) eller den monomeriske fluorescerende rødforskjøvet variant av GFP mCherry12,13. Imidlertid er en stor mangel på BDNF overuttrykk at det eliminerer muligheten for å levere kjente konsentrasjoner av denne nevrotrophin. Det kan også føre til cellulær toksisitet, som skjuler tolkningen av resultatene14. En alternativ strategi er transfeksjon av en epitop-merket TrkB, for eksempel Flag-TrkB. Denne metodikken gjør det mulig å studere TrkB internaliseringsdynamikk15, men det innebærer også transfeksjon, noe som kan resultere i endret TrkB-funksjon og cellulær toksisitet. For å overvinne disse metodiske hindringer, rekombinant varianter av NGF og BDNF inneholder en Avi sekvens (BDNFAvi), som kan være mono-biotinylated av biotin-ligase enzymet BirA, ble utviklet16,17. Biotinylert rekombinant BDNF kan kobles til forskjellige streptavidin-bundne verktøy, som inkluderer fluorofos, perler, paramagnetiske nanopartikler blant annet for deteksjon. Når det gjelder levende celleavbildning, har kvanteprikker (QD) blitt ofte brukt fluoroforeer, da de har ønskelige egenskaper for enkeltpartikkelsporing, for eksempel økt lysstyrke og motstand mot fotobleking sammenlignet med små molekylfluorophores18.
Produksjonen av mono-biotinylert BDNF (mbtBDNF) ved hjelp av BDNFAvi er oppnådd ved samtidig transfeksjon av plasmider som driver uttrykket av BDNFAvi og BirA, etterfulgt av rensing av rekombinant protein ved affinitet kromatografi med et utbytte på 1-2 μg BDNF per 20 ml HEK293-condition kultur media17. Her foreslår vi en endring av denne protokollen som gjør det mulig for BDNFAvi rensing fra 500 ml HEK293-conditioned media, som søker å maksimere protein utvinning i en kromatografi-kolonne basert protokoll for enkel manipulering. Det brukte transfeksjonsmidlet, polyetylenimin (PEI), sikrer en kostnadseffektiv metode uten å ofre transfeksjonsutbytte. Mono-biotinylation trinnet har blitt tilpasset en in vitro reaksjon for å unngå komplikasjoner forbundet med co-transfections og for å sikre homogen merking av BDNF. Den biologiske aktiviteten til mbtBDNF ble demonstrert av vestlige blot- og fluorescensmikroskopieksperimenter, inkludert aktivering av pCREB og levende celleavbildning for å studere retrograd aksonal transport av BDNF i mikrofluidiske kamre. Bruken av denne protokollen muliggjør optimalisert, høykapasitetsproduksjon av homogen mono-biotinylert og biologisk aktiv BDNF.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikkelen er en optimalisert metodikk for produksjon og rensing av mbtBDNF i en affinitet kromatografi-basert prosedyre beskrevet, basert på arbeidet til Sung og samarbeidspartnere17. Optimaliseringene inkluderer bruk av en kostnadseffektiv transfeksjonsreagens (PEI) samtidig som effektiviteten av dyrere transfeksjonsmetoder som lipofectamin opprettholdes. Denne optimaliseringen oversettes til en betydelig kostnadsreduksjon i protokollen, noe som muliggjør skalerbarhet samtidig som den …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkjenner takknemlig økonomisk støtte fra Fondecyt (1171137) (FCB), Basal Center of Excellence in Science and Technology (AFB 170005) (FCB), Millenium-Nucleus (P07/011-F) (FCB), Wellcome Trust Senior Investigator Award (107116/Z/15/Z) (GS) og en UK Dementia Research Institute Foundation award (GS). Dette arbeidet ble støttet av Unidad de Microscopía Avanzada UC (UMA UC).
Materials
| 2 way stopcock | BioRad | 7328102 | Chromatography apparatus component |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | BDNF elution buffer |
| Acrylamide/Bisacrylamide | BioRad | 1610154 | SDS-PAGE gel preparation |
| Amicon Ultra-15 10K | Millipore | UFC901024 | BDNF concentration |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A9164 | SDS-PAGE gel preparation |
| anti B-III-Tubulin antibody | Sigma | T8578 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti BDNF antibody | Alomone | AGP-021 | Western blot assays for BDNF quantification |
| anti BDNF antibody | Alomone | ANT-010 | Western blot assays for BDNF quantification |
| Anti ERK antibody | Cell Signaling | 9102 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pCREB antibody (S133) | Cell Signaling | 9198 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pERK antibody (T202, Y204) | Cell Signaling | 4370 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pTrkB antibody (Y515) | Abcam | ab109684 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-062 | HEK293 maintenance |
| ATP | Sigma | A26209 | BDNF monobiotinylation buffer |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | Neuron maintenance |
| Bicine | Sigma | B3876 | BDNF monobiotinylation buffer |
| BirA-GST | BPS Bioscience | 70031 | Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation |
| Bovine Fetal Serum | HyClone | HC.SH30396.02 | HEK293 maintenance |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence |
| D-Biotin | Sigma | B4639 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| DMEM High Glucose Medium | Gibco | 11965-092 | Neuron seeding |
| DMEM Medium | Gibco | 11995-081 | HEK293 maintenance |
| Econo Column Funnel | BioRad | 7310003 | Chromatography apparatus component |
| EDTA | Merck | 108418 | |
| EZ-ECL Kit | Biological Industries | 1633664 | Protein detection by western blotting |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Neuron and HEK293 maintenance |
| Glycerol | Merck | 104094 | BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays |
| Hettich Rotina 46R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for clearing the medium of debris |
| Hettich Universal 32R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for protein concentrator centrifugation |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Neuron seeding |
| ImageQuant LAS 500 | GE Healthcare Life Sciences | 29005063 | Western blot image acquisition |
| Imidazole | Sigma | I55513 | BDNF buffer modification component |
| KCl | Winkler | BM-1370 | PBS component |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | PBS component |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Luer Tubing Adaptor | BioRad | 7323245 | Chromatography apparatus component |
| Luminata™ Forte Western HRP Substrate | Millipore | WBLUF0100 | Protein detection by western blotting |
| Mg(CH3COO)2 | Merck | 105819 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | Mounting reagent for immunofluorescence assays |
| MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads | Invitrogen | 65001 | Biotinylation verification |
| Na2HPO4 | Merck | 106586 | BDNF buffer modification component |
| NaCl | Winkler | BM-1630 | PBS component, BDNF buffer modification component |
| NaH2PO4 | Merck | 106346 | BDNF buffer modification component |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Neuron maintenance |
| Ni-NTA Agarose Beads | Qiagen | 30210 | BDNF AviTag purification |
| Nikon Ti2-E | Nikon | Microscope for fluorescence imaging | |
| Nitrocellulose Membrane | BioRad | 1620115 | Protein transfer for western blotting |
| ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | Camera for epifluorescence imaging |
| P8340 Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | BDNF buffer modification component |
| Paraformaldehyde | Merck | 104005 | Fixative for immunofluorescence assays |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Neuron maintenance |
| Poli-D-Lysine | Corning | DLW354210 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Poli-L-Lysine | Millipore | P2363 | Cover coating for non-compartmentalized neurons |
| Poly-Prep Chromatography Column | BioRad | 7311550 | Chromatography apparatus component |
| Polyethyleneimine 25K | Polysciences Inc. | PLY-0296 | HEK293 transfection |
| Quantum Dots 655 streptavidin conjugate | Invitrogen | Q10121MP | Monobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments |
| Saponin | Sigma | S4521 | Detergent for immunofluorescence assays |
| Sucrose | Merck | 107687 | |
| Syldgard 184 silicone elastomer base | Poirot | 4019862 | Microfluidic chamber preparation |
| TEMED | Sigma | T9281 | SDS-PAGE gel preparation |
| Tris | Winkler | BM-2000 | Lysis buffer component |
| Triton X100 | Merck | 108603 | Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays |
| Trypsin-EDTA 0.5% | Gibco | 15400-054 | HEK293 passaging |
References
- Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
- Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology. 846, 1-12 (2012).
- Gonzalez, A., Moya-Alvarado, G., Gonzalez-Billault, C., Bronfman, F. C. Cellular and molecular mechanism regulating neuronal growth by brain-derived neurotrophic factor. Cytoskeleton. 73 (10), 612-628 (2016).
- Cunha, C., Brambilla, R., Thomas, K. A simple role for BDNF in learning and memory. Frontiers in Mollecular Neuroscience. 3, 1 (2010).
- Bronfman, F. C., Lazo, O. M., Flores, C., Escudero, C. A., Lewin, G., Carter, B. Spatiotemporal intracelular dynamics of neurotrophin and its receptors. Implications for neurotrophin signaling and neuronal function. Neurotrophic Factor. Handbook of Experimental Pharmacology. 220, (2014).
- Ascano, M., Bodmer, D., Kuruvilla, R. Endocytic trafficking of neurotrophins in neural development. Trends in Cell Biology. 22 (5), 266-273 (2012).
- Deinhardt, K., Salinas, S., Verastegui, C., Watson, R., Worth, D., Hanrahan, S., Bucci, C., Schiavo, G. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293 (2006).
- Escudero, C. A., et al. c-Jun N-terminal kinase (JNK)-dependent internalization and Rab5-dependent endocytic sorting medaited long-distance retrograde neuronal death induced by axonal BDNF-p75 signaling. Scientific Reports. 9, 6070 (2019).
- Vrabec, J. P., Levin, L. A. The neurobiology of cell death in glaucoma. Eye. 21, 11-14 (2007).
- Liot, G., Zala, D., Pla, P., Mottet, G., Piel, M., Saudou, F. Mutant huntingtin alters retrograde transport of TrkB receptors in striatal dendrites. Journal of Neuroscience. 33 (15), 6298-6309 (2013).
- Zhou, B., Cai, Q., Xie, Y., Sheng, Z. H. Snapin recruits dynein to BDNF-TrkB signaling endosomes for retrograde axonal transport and is essential for dendrite growth of cortical neurons. Cell Reports. 2 (1), 42-51 (2012).
- Haubensak, W., Narz, F., Heumann, R., Lessmann, V. BDNF-GFP containing secretory granules are localized in the vicinity of synaptic junctions of cultured cortical neurons. Journal of Cell Science. 111 (11), 1483-1493 (1998).
- Adachi, N., et al. Glucocorticoid affects dendritic transport of BDNF-containing vesicles. Scientific Reports. 5, 12684 (2015).
- Biocompare: The Buyer’s Guide for Life Scientists. Mirus Bio. Cellular Toxicity Caused by Transfection: Why is it important Available from: https://www.biocompare.com/Bench-Tips/121111-Cellular-Toxicity-Caused-by-Transfection-Why-is-it-important/ (2012)
- Zhao, L., et al. Mechanism underlying activity-dependent insertion of TrkB into the neuronal surface. Journal of Cell Science. 122 (17), 3123-3136 (2009).
- Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A., Pearn, M., Mobley, W., Wu, C. Real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled BDNF in primary neurons. Journal of Visualized Experiments. 91, 51899 (2014).
- Sung, K., Maloney, M., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of Neuroscience Methods. 200 (2), 121-128 (2011).
- Deerinck, T. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
- Unsain, N., Nuñez, N., Anastasia, A., Mascó, D. H. Status epilepticus induces a TrkB to p75 neurotrophin receptor switch and increases brain-derived neurotrophic factor interaction with p75 neurotrophon receptor: an initial event in neuronal injury induction. Neurosciences. 154 (3), 978-993 (2008).
- Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
- Moya-Alvarado, G., Gonzalez, A., Stuardo, N., Bronfman, F. C. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) regulates Rab5-positive early endosomes in hippocampal neurons to induce dendritic branching. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 493 (2018).
- Sasi, M., Vignoli, B., Canossa, M., Blum, R. Neurobiology of local and intercellular BDNF signaling. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 469 (5), 593-610 (2017).
- . The Rab5-Rab11 endosomal pathway is required for BDNF-induced CREB transcriptional regulation in neurons Available from: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/844720v1 (2019)
- Mowla, , et al. Biosynthesis and post-translational processing of the precursor to brain-derived neurotrophic factor. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12660-12666 (2001).
- Longo, P., Kavran, J., Kim, M. S., Leahy, D. Transient Mammalian Cell Transfection with Polyethyleneimine (PEI). Methods in Enzymology. 529, 227-240 (2013).
- Raymond, C., Tom, R., Perret, S., Moussouami, P., L’Abbé, D., St-Laurent, G., Durocher, Y. A simplified polyethyleneimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods. 55 (1), 44-51 (2011).
- Dalton, A., Barton, W. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
- Hunter, M., Yuan, P., Vavilala, D., Fox, M. Optimization of protein expression in mammalian cells. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 77 (2019).
- Stepanenko, A. A., Heng, H. H. Transient and stable vector transfection: Pitfalls, off-target effects, artifacts. Mutation Research. 773, 91-103 (2017).
- Guerzoni, L. P., Nicolas, V., Angelova, A. In vitro modulation of TrkB receptor signaling upon sequential delivery of curcumin-DHA loaded carriers towards promoting neuronal survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
- Angelova, A., Angelov, B. Dual and multi-drug delivery nanoparticles towards neuronal survival and synaptic repair. Neural Regeneration Research. 12 (6), 886-889 (2017).
