Um protocolo aprimorado para purificar e diretamente mono-biocombinado recombinante BDNF em um tubo para estudos de tráfico celular em neurônios
Summary
BDNF recombinante contendo uma sequência de Avi (BDNFAvi) é produzido em células HEK293 de forma econômica e é purificado por cromatografia de afinidade. BDNFavi é então diretamente mono-biotiningado com a enzima BirA em um tubo. BDNFavi e BDNFavi mono-biotiniladas mantêm sua atividade biológica quando comparadas com bdnf disponíveis comercialmente.
Abstract
BDNF recombinante contendo uma sequência de Avi (BDNFAvi) é produzido em células HEK293 e, em seguida, purificado por cromatografia de afinidade. Um protocolo reprodutível foi desenvolvido para mono-biotinilato BDNFAvi com a enzima BirA em um tubo. Nesta reação, o BDNFAvi mono-biotinilado mantém sua atividade biológica.
Neurotrophins são fatores de crescimento derivados da meta que desempenham um papel no desenvolvimento e manutenção neuronal. Eles requerem mecanismos de transporte rápido ao longo da via endocítica para permitir a sinalização de longa distância entre diferentes compartimentos neuronais. O desenvolvimento de ferramentas moleculares para estudar o tráfico de neurotrophins permitiu o rastreamento preciso dessas proteínas na célula usando o registro in vivo. Neste protocolo, desenvolvemos um procedimento otimizado e econômico para a produção de BDNF mono-biotinilado. Uma variante BDNF recombinante contendo uma sequência avi biotinítil (BDNFAvi) é produzida em células HEK293 na faixa de microgramas e, em seguida, purificada em um procedimento facilmente escalável usando cromatografia de afinidade. O BDNF purificado pode então ser homogêneo mono-biotiningado por uma reação in vitro direta com a enzima BirA em um tubo. A atividade biológica do BDNF mono-biotinilato (mbtBDNF) pode ser conjugada a extenuante conjugados a diferentes fluoroforos. BDNFAvi e mbtBDNF mantêm sua atividade biológica demonstrada através da detecção de alvos fosfoilados a jusante usando mancha ocidental e ativação do fator de transcrição CREB, respectivamente. Usando pontos streptavidin-quânticos, pudemos visualizar a internalização mbtBDNF concomitante com ativação do CREB, que foi detectado com um anticorpo específico fosfo-CREB. Além disso, mbtBDNF conjugado a pontos streptavidin-quânticos foi adequado para análise de transporte retrógrado em neurônios corticais cultivados em câmaras microfluidas. Assim, no tubo produzido mbtBDNF é uma ferramenta confiável para estudar a sinalização fisiológica e o tráfico de neurônios.
Introduction
Os neurônios são as unidades funcionais do sistema nervoso que possuem uma morfologia complexa e especializada que permite a comunicação sináptica e, portanto, a geração de comportamento coordenado e complexo em resposta a diversos estímulos. Projeções neuronais como dendritos e axônios são características estruturais críticas envolvidas na comunicação neuronal, e neurotrophins são atores cruciais na determinação de sua morfologia e função1. Neurotrophins são uma família de fatores de crescimento secretos que incluem NGF, NT-3, NT-4 e fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)2. No sistema nervoso central (SNC), o BDNF participa de diversos processos biológicos, incluindo neurotransmissão, arborização dendrítica, maturação de colunas dendríticas, potencialização a longo prazo, entre outros3,,4. Portanto, o BDNF desempenha um papel crítico na regulação da função neuronal.
Diversos processos celulares regulam a dinâmica e a função do BDNF. Na superfície neuronal, o BDNF liga o receptor de tropomyosina quinase B (TrkB) e/ou o receptor de neurotropfina p75 (p75). Os complexos BDNF-TrkB e BDNF-p75 são endocitados e classificados em diferentes organelas endocíticas5,,6,,7,,8. O correto tráfico intracelular do complexo BDNF/TrkB é necessário para sinalização BDNF adequada em diferentes circuitos neuronais9,,10,,11. Por essa razão, uma compreensão profunda da dinâmica do tráfico de BDNF e suas alterações encontradas nos processos fisiofisiológicos é essencial para compreender a sinalização de BDNF em saúde e doença. O desenvolvimento de novas e específicas ferramentas moleculares para monitorar esse processo ajudará a impulsionar este campo e permitirá uma melhor compreensão dos mecanismos regulatórios envolvidos.
Existem várias ferramentas disponíveis para o estudo do tráfico de BDNF em neurônios. Uma metodologia comumente utilizada envolve a transfecção de BDNF recombinante marcado com moléculas fluorescentes como proteína fluorescente verde (GFP) ou a variante monomérica fluorescente de mudança vermelha do GFP mCherry12,13. No entanto, uma grande deficiência da superexpressão do BDNF é que elimina a possibilidade de fornecer concentrações conhecidas dessa neurotropina. Além disso, pode resultar em toxicidade celular, obscurecendo a interpretação dos resultados14. Uma estratégia alternativa é a transfecção de um TrkB marcado por epitope, como Flag-TrkB. Essa metodologia permite o estudo da dinâmica de internalização TrkB15,mas também envolve transfecção, o que pode resultar em alteração da função TrkB e toxicidade celular. Para superar esses obstáculos metodológicos, foram desenvolvidas variantes recombinantes de NGF e BDNF contendo uma sequência avi (BDNFAvi), que pode ser mono-biointinalada pela enzima biotin-ligase BirA,16,,17. BDNF recombinante biotinína pode ser acoplado a diferentes ferramentas ligadas a streptavidin, que incluem fluoroforos, contas, nanopartículas paramagnéticas, entre outras para detecção. Em termos de imagem de células vivas, os pontos quânticos (QD) tornaram-se fluoroforos frequentemente utilizados, pois possuem características desejáveis para o rastreamento de partículas únicas, como aumento do brilho e resistência ao fotobleaching quando comparados com fluoroforos de molécula pequena18.
A produção de BDNF mono-biotinilado (mbtBDNF) usando BDNFAvi foi alcançada pela co-transfecção de plasmídeos que conduzem a expressão de BDNFAvi e BirA, seguido pela purificação da proteína recombinante por cromatografia de afinidade com um rendimento de 1-2 μg de BDNF por 20 mL de mídia cultural hek293-condicionada17. Aqui, propomos uma modificação deste protocolo que permite a purificação do BDNFAvi a partir de 500 mL de mídia hek293, que busca maximizar a recuperação de proteínas em um protocolo baseado em coluna cromatografia para facilitar a manipulação. O agente de transfecção usado, polietileneimina (PEI), garante um método econômico sem sacrificar o rendimento da transfecção. A etapa de mono-biotintilação foi adaptada a uma reação in vitro para evitar as complicações associadas às co-transfecções e garantir a rotulagem homogênea de BDNF. A atividade biológica do mbtBDNF foi demonstrada por experimentos de microscopia de bolhas ocidentais e fluorescência, incluindo ativação de pCREB e imagem de células vivas para estudar o transporte axonal retrógrado de BDNF em câmaras microfluidas. O uso deste protocolo permite uma produção otimizada e de alto rendimento de BDNF mono-biotinilado e biologicamente ativo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste artigo, descreve-se uma metodologia otimizada para a produção e purificação do mbtBDNF em um procedimento baseado em cromatografia de afinidade, a partir do trabalho de Sung e colaboradores17. As otimizações incluem o uso de um reagente de transfecção econômico (PEI) mantendo a eficiência de métodos de transfecção mais caros, como a lipofectamina. Essa otimização se traduz em uma redução significativa de custos no protocolo, permitindo a escalabilidade, mantendo o alto custo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem o apoio financeiro da Fondecyt (1171137) (FCB), do Centro Basal de Excelência em Ciência e Tecnologia (AFB 170005) (FCB), do Millenium-Nucleus (FCB). P07/011-F) (FCB), o Wellcome Trust Senior Investigator Award (107116/Z/15/Z) (GS) e um prêmio da Uk Dementia Research Institute Foundation (GS). Este trabalho contou com o apoio da Unidad de Microscopía Avanzada UC (UMA UC).
Materials
| 2 way stopcock | BioRad | 7328102 | Chromatography apparatus component |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | BDNF elution buffer |
| Acrylamide/Bisacrylamide | BioRad | 1610154 | SDS-PAGE gel preparation |
| Amicon Ultra-15 10K | Millipore | UFC901024 | BDNF concentration |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A9164 | SDS-PAGE gel preparation |
| anti B-III-Tubulin antibody | Sigma | T8578 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti BDNF antibody | Alomone | AGP-021 | Western blot assays for BDNF quantification |
| anti BDNF antibody | Alomone | ANT-010 | Western blot assays for BDNF quantification |
| Anti ERK antibody | Cell Signaling | 9102 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pCREB antibody (S133) | Cell Signaling | 9198 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pERK antibody (T202, Y204) | Cell Signaling | 4370 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pTrkB antibody (Y515) | Abcam | ab109684 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-062 | HEK293 maintenance |
| ATP | Sigma | A26209 | BDNF monobiotinylation buffer |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | Neuron maintenance |
| Bicine | Sigma | B3876 | BDNF monobiotinylation buffer |
| BirA-GST | BPS Bioscience | 70031 | Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation |
| Bovine Fetal Serum | HyClone | HC.SH30396.02 | HEK293 maintenance |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence |
| D-Biotin | Sigma | B4639 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| DMEM High Glucose Medium | Gibco | 11965-092 | Neuron seeding |
| DMEM Medium | Gibco | 11995-081 | HEK293 maintenance |
| Econo Column Funnel | BioRad | 7310003 | Chromatography apparatus component |
| EDTA | Merck | 108418 | |
| EZ-ECL Kit | Biological Industries | 1633664 | Protein detection by western blotting |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Neuron and HEK293 maintenance |
| Glycerol | Merck | 104094 | BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays |
| Hettich Rotina 46R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for clearing the medium of debris |
| Hettich Universal 32R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for protein concentrator centrifugation |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Neuron seeding |
| ImageQuant LAS 500 | GE Healthcare Life Sciences | 29005063 | Western blot image acquisition |
| Imidazole | Sigma | I55513 | BDNF buffer modification component |
| KCl | Winkler | BM-1370 | PBS component |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | PBS component |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Luer Tubing Adaptor | BioRad | 7323245 | Chromatography apparatus component |
| Luminata™ Forte Western HRP Substrate | Millipore | WBLUF0100 | Protein detection by western blotting |
| Mg(CH3COO)2 | Merck | 105819 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | Mounting reagent for immunofluorescence assays |
| MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads | Invitrogen | 65001 | Biotinylation verification |
| Na2HPO4 | Merck | 106586 | BDNF buffer modification component |
| NaCl | Winkler | BM-1630 | PBS component, BDNF buffer modification component |
| NaH2PO4 | Merck | 106346 | BDNF buffer modification component |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Neuron maintenance |
| Ni-NTA Agarose Beads | Qiagen | 30210 | BDNF AviTag purification |
| Nikon Ti2-E | Nikon | Microscope for fluorescence imaging | |
| Nitrocellulose Membrane | BioRad | 1620115 | Protein transfer for western blotting |
| ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | Camera for epifluorescence imaging |
| P8340 Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | BDNF buffer modification component |
| Paraformaldehyde | Merck | 104005 | Fixative for immunofluorescence assays |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Neuron maintenance |
| Poli-D-Lysine | Corning | DLW354210 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Poli-L-Lysine | Millipore | P2363 | Cover coating for non-compartmentalized neurons |
| Poly-Prep Chromatography Column | BioRad | 7311550 | Chromatography apparatus component |
| Polyethyleneimine 25K | Polysciences Inc. | PLY-0296 | HEK293 transfection |
| Quantum Dots 655 streptavidin conjugate | Invitrogen | Q10121MP | Monobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments |
| Saponin | Sigma | S4521 | Detergent for immunofluorescence assays |
| Sucrose | Merck | 107687 | |
| Syldgard 184 silicone elastomer base | Poirot | 4019862 | Microfluidic chamber preparation |
| TEMED | Sigma | T9281 | SDS-PAGE gel preparation |
| Tris | Winkler | BM-2000 | Lysis buffer component |
| Triton X100 | Merck | 108603 | Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays |
| Trypsin-EDTA 0.5% | Gibco | 15400-054 | HEK293 passaging |
References
- Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
- Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology. 846, 1-12 (2012).
- Gonzalez, A., Moya-Alvarado, G., Gonzalez-Billault, C., Bronfman, F. C. Cellular and molecular mechanism regulating neuronal growth by brain-derived neurotrophic factor. Cytoskeleton. 73 (10), 612-628 (2016).
- Cunha, C., Brambilla, R., Thomas, K. A simple role for BDNF in learning and memory. Frontiers in Mollecular Neuroscience. 3, 1 (2010).
- Bronfman, F. C., Lazo, O. M., Flores, C., Escudero, C. A., Lewin, G., Carter, B. Spatiotemporal intracelular dynamics of neurotrophin and its receptors. Implications for neurotrophin signaling and neuronal function. Neurotrophic Factor. Handbook of Experimental Pharmacology. 220, (2014).
- Ascano, M., Bodmer, D., Kuruvilla, R. Endocytic trafficking of neurotrophins in neural development. Trends in Cell Biology. 22 (5), 266-273 (2012).
- Deinhardt, K., Salinas, S., Verastegui, C., Watson, R., Worth, D., Hanrahan, S., Bucci, C., Schiavo, G. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293 (2006).
- Escudero, C. A., et al. c-Jun N-terminal kinase (JNK)-dependent internalization and Rab5-dependent endocytic sorting medaited long-distance retrograde neuronal death induced by axonal BDNF-p75 signaling. Scientific Reports. 9, 6070 (2019).
- Vrabec, J. P., Levin, L. A. The neurobiology of cell death in glaucoma. Eye. 21, 11-14 (2007).
- Liot, G., Zala, D., Pla, P., Mottet, G., Piel, M., Saudou, F. Mutant huntingtin alters retrograde transport of TrkB receptors in striatal dendrites. Journal of Neuroscience. 33 (15), 6298-6309 (2013).
- Zhou, B., Cai, Q., Xie, Y., Sheng, Z. H. Snapin recruits dynein to BDNF-TrkB signaling endosomes for retrograde axonal transport and is essential for dendrite growth of cortical neurons. Cell Reports. 2 (1), 42-51 (2012).
- Haubensak, W., Narz, F., Heumann, R., Lessmann, V. BDNF-GFP containing secretory granules are localized in the vicinity of synaptic junctions of cultured cortical neurons. Journal of Cell Science. 111 (11), 1483-1493 (1998).
- Adachi, N., et al. Glucocorticoid affects dendritic transport of BDNF-containing vesicles. Scientific Reports. 5, 12684 (2015).
- Biocompare: The Buyer’s Guide for Life Scientists. Mirus Bio. Cellular Toxicity Caused by Transfection: Why is it important Available from: https://www.biocompare.com/Bench-Tips/121111-Cellular-Toxicity-Caused-by-Transfection-Why-is-it-important/ (2012)
- Zhao, L., et al. Mechanism underlying activity-dependent insertion of TrkB into the neuronal surface. Journal of Cell Science. 122 (17), 3123-3136 (2009).
- Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A., Pearn, M., Mobley, W., Wu, C. Real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled BDNF in primary neurons. Journal of Visualized Experiments. 91, 51899 (2014).
- Sung, K., Maloney, M., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of Neuroscience Methods. 200 (2), 121-128 (2011).
- Deerinck, T. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
- Unsain, N., Nuñez, N., Anastasia, A., Mascó, D. H. Status epilepticus induces a TrkB to p75 neurotrophin receptor switch and increases brain-derived neurotrophic factor interaction with p75 neurotrophon receptor: an initial event in neuronal injury induction. Neurosciences. 154 (3), 978-993 (2008).
- Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
- Moya-Alvarado, G., Gonzalez, A., Stuardo, N., Bronfman, F. C. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) regulates Rab5-positive early endosomes in hippocampal neurons to induce dendritic branching. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 493 (2018).
- Sasi, M., Vignoli, B., Canossa, M., Blum, R. Neurobiology of local and intercellular BDNF signaling. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 469 (5), 593-610 (2017).
- . The Rab5-Rab11 endosomal pathway is required for BDNF-induced CREB transcriptional regulation in neurons Available from: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/844720v1 (2019)
- Mowla, , et al. Biosynthesis and post-translational processing of the precursor to brain-derived neurotrophic factor. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12660-12666 (2001).
- Longo, P., Kavran, J., Kim, M. S., Leahy, D. Transient Mammalian Cell Transfection with Polyethyleneimine (PEI). Methods in Enzymology. 529, 227-240 (2013).
- Raymond, C., Tom, R., Perret, S., Moussouami, P., L’Abbé, D., St-Laurent, G., Durocher, Y. A simplified polyethyleneimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods. 55 (1), 44-51 (2011).
- Dalton, A., Barton, W. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
- Hunter, M., Yuan, P., Vavilala, D., Fox, M. Optimization of protein expression in mammalian cells. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 77 (2019).
- Stepanenko, A. A., Heng, H. H. Transient and stable vector transfection: Pitfalls, off-target effects, artifacts. Mutation Research. 773, 91-103 (2017).
- Guerzoni, L. P., Nicolas, V., Angelova, A. In vitro modulation of TrkB receptor signaling upon sequential delivery of curcumin-DHA loaded carriers towards promoting neuronal survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
- Angelova, A., Angelov, B. Dual and multi-drug delivery nanoparticles towards neuronal survival and synaptic repair. Neural Regeneration Research. 12 (6), 886-889 (2017).
