Rekombinant BDNF indeholdende en Avi-sekvens (BDNFAvi) fremstilles i HEK293-celler på en omkostningseffektiv måde og renses ved affinitetskromatografi. BDNFavi monobiotinyliseres derefter direkte med enzymet BirA i et rør. BDNFavi og mono-biotinyleret BDNFavi bevarer deres biologiske aktivitet sammenlignet med kommercielt tilgængelige BDNF.
Rekombinant BDNF indeholdende en Avi-sekvens (BDNFAvi) fremstilles i HEK293-celler og renses derefter omkostningseffektivt ved affinitetskromatografi. En reproducerbar protokol blev udviklet til direkte mono-biotinylate BDNFAvi med enzymet BirA i et rør. I denne reaktion bevarer monobiotinyleret BDNFAvi sin biologiske aktivitet.
Neurotropiner er målafledte vækstfaktorer spiller en rolle i neuronal udvikling og vedligeholdelse. De kræver hurtige transportmekanismer langs endocytic vej til at tillade langdistance signalering mellem forskellige neuronal rum. Udviklingen af molekylære værktøjer til at studere handel med neurotropiner har gjort det muligt at præcis sporing af disse proteiner i cellen ved hjælp af in vivo optagelse. I denne protokol udviklede vi en optimeret og omkostningseffektiv procedure til produktion af monobiotinyleret BDNF. En rekombinant BDNF-variant, der indeholder en biotinylabel avi-sekvens (BDNFAvi), fremstilles i HEK293-celler i mikrogramområdet og renses derefter i en let skalerbar procedure ved hjælp af affinitetskromatografi. Den rensede BDNF kan derefter homogent mono-biotinyliseres ved en direkte in vitro-reaktion med enzymet BirA i et rør. Den biologiske aktivitet af den monobiotinylerede BDNF (mbtBDNF) kan konjugeres til streptavidin-konjugeret til forskellige fluorophores. BDNFAvi og mbtBDNF bevarer deres biologiske aktivitet, der er påvist ved påvisning af downstream fosforylerede mål ved hjælp af henholdsvis western blot og aktivering af transskriptionsfaktoren CREB. Ved hjælp af streptavidin-quantum prikker, vi var i stand til at visualisere mbtBDNF internalisering samtidig med aktivering af CREB, som blev opdaget med en fosfor-CREB specifikke antistof. Desuden var mbtBDNF konjugeret til streptavidin-kvanteprikker egnet til retrograd transportanalyse i kortikale neuroner dyrket i mikrofluidiske kamre. Således, i rør produceret mbtBDNF er et pålideligt værktøj til at studere fysiologiske signalering endosome dynamik og handel med neuroner.
Neuroner er de funktionelle enheder i nervesystemet besidder en kompleks og specialiseret morfologi, der giver mulighed for synaptisk kommunikation, og dermed, generering af koordineret og kompleks adfærd som reaktion på forskellige stimuli. Neuronal fremskrivninger såsom dendritter og axoner er kritiske strukturelle funktioner, der er involveret i neuronal kommunikation, og neurotrophins er afgørende aktører i fastsættelsen af deres morfologi og funktion1. Neurotropiner er en familie af udskilles vækstfaktorer, der omfatter NGF, NT-3, NT-4, og hjerne-afledt neurotrofisk faktor (BDNF)2. I centralnervesystemet (CNS), BDNF deltager i forskellige biologiske processer, herunder neurotransmission, dendritiske arborization, modning af dendritiske pigge, langsigtet potensering, blandt andre3,4. Derfor spiller BDNF en afgørende rolle i reguleringen af neuronal funktion.
Forskellige celleprocesser regulerer BDNF-dynamik og -funktion. På neuronal overflade binder BDNF tropomyosin receptorkinase B (TrkB) og/eller p75 neurotrophin receptor (p75). BDNF-TrkB- og BDNF-p75-komplekserne er endocytosed og sorteret i forskellige endocytiske organeller5,6,7,8. Korrekt intracellulær handel med BDNF/TrkB-komplekset er nødvendig for korrekt BDNF-signalering i forskellige neuronale kredsløb9,10,11. Af denne grund, en dyb forståelse af BDNF menneskehandel dynamik og dens ændringer findes i patofysiologiske processer er afgørende for at forstå BDNF signalering i sundhed og sygdom. Udviklingen af nye og specifikke molekylære værktøjer til overvågning af denne proces vil bidrage til at fremme dette område og give mulighed for en bedre forståelse af de involverede reguleringsmekanismer.
Der er flere værktøjer til rådighed for studiet af BDNF handel med neuroner. En almindeligt anvendt metode omfatter transinfektion af rekombinant BDNF mærket med fluorescerende molekyler såsom grønt fluorescerende protein (GFP) eller den monomeriske fluorescerende rød-forskudt variant af GFP mCherry12,13. Men, en stor mangel ved BDNF overekspression er, at det eliminerer muligheden for at levere kendte koncentrationer af denne neurotrophin. Også, Det kan resultere i cellulære toksicitet, tilsløre fortolkningen af resultater14. En alternativ strategi er transfektion af en epitop-tagged TrkB, såsom Flag-TrkB. Denne metode gør det muligt at studere TrkB internalisering dynamik15,men det indebærer også transfection, hvilket kan resultere i ændret TrkB funktion og cellulære toksicitet. For at overvinde disse metodologiske forhindringer blev der udviklet16 , 17.17 Biotinyleret rekombinant BDNF kan kobles til forskellige streptavidin-bundne værktøjer, som omfatter fluorophores, perler, paramagnetiske nanopartikler blandt andet til påvisning. Med hensyn til live-celle billeddannelse, kvanteprikker (QD) er blevet hyppigt anvendt fluorophores, da de har ønskelige egenskaber for enkelt-partikel tracking, såsom øget lysstyrke og modstandsdygtighed over for fotobleaching sammenlignet med små molekyle fluorophores18.
Produktionen af monobiotinyleret BDNF (mbtBDNF) ved hjælp af BDNFAvi er opnået ved co-transfektion af plasmider, der driver udtrykket BDNFAvi og BirA, efterfulgt af rensning af rekombinant protein ved affinitetkromatografi med et udbytte på 1-2 μg BDNF pr. 20 ml HEK293-betinget dyrkningsmedie17. Her foreslår vi en ændring af denne protokol, der giver mulighed for BDNFAvi rensning fra 500 ml HEK293-betingede medier, som søger at maksimere proteingenvinding i en kromatografi-kolonnebaseret protokol for at lette manipulation. Det anvendte transfekturemiddel, polyethylenimidin (PEI), sikrer en omkostningseffektiv metode uden at gå på kompromis med transfektureudbyttet. Monobiotinyleringstrinnet er blevet tilpasset en in vitro-reaktion for at undgå de komplikationer, der er forbundet med co-transinfektioner, og for at sikre ensartet mærkning af BDNF. Den biologiske aktivitet af mbtBDNF blev påvist ved vestlige blot og fluorescens mikroskopi eksperimenter, herunder aktivering af pCREB og levende celle billeddannelse til at studere retrograd axonal transport af BDNF i mikrofluidiske kamre. Anvendelsen af denne protokol giver mulighed for optimeret, højtydende produktion af homogen monobiotinylerede og biologisk aktive BDNF.
I denne artikel beskrives en optimeret metode til produktion og rensning af mbtBDNF i en affinitetskromatografibaseret procedure baseret på Sungs og samarbejdspartneresarbejde 17. Optimeringerne omfatter brugen af et omkostningseffektivt transfekturereagens (PEI), samtidig med at effektiviteten af dyrere transfektionsmetoder såsom lipofectamin bevares. Denne optimering giver sig udslag i en betydelig omkostningsreduktion i protokollen, hvilket giver mulighed for skalerbarhed, samtidig med at der…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne taknemmeligt anerkende finansiel støtte fra Fondecyt (1171137) (FCB), Basal Center of Excellence i Videnskab og Teknologi (AFB 170005) (FCB), Millenium-Nucleus (P07/011-F) (FCB), Wellcome Trust Senior Investigator Award (107116/Z/15/Z) (GS) og en britisk Demens Research Institute Foundation award (GS). Dette arbejde blev støttet af Unidad de Microscopía Avanzada UC (UMA UC).
2 way stopcock | BioRad | 7328102 | Chromatography apparatus component |
2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | BDNF elution buffer |
Acrylamide/Bisacrylamide | BioRad | 1610154 | SDS-PAGE gel preparation |
Amicon Ultra-15 10K | Millipore | UFC901024 | BDNF concentration |
Ammonium Persulfate | Sigma | A9164 | SDS-PAGE gel preparation |
anti B-III-Tubulin antibody | Sigma | T8578 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
anti BDNF antibody | Alomone | AGP-021 | Western blot assays for BDNF quantification |
anti BDNF antibody | Alomone | ANT-010 | Western blot assays for BDNF quantification |
Anti ERK antibody | Cell Signaling | 9102 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
anti pCREB antibody (S133) | Cell Signaling | 9198 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
anti pERK antibody (T202, Y204) | Cell Signaling | 4370 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
anti pTrkB antibody (Y515) | Abcam | ab109684 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-062 | HEK293 maintenance |
ATP | Sigma | A26209 | BDNF monobiotinylation buffer |
B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | Neuron maintenance |
Bicine | Sigma | B3876 | BDNF monobiotinylation buffer |
BirA-GST | BPS Bioscience | 70031 | Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation |
Bovine Fetal Serum | HyClone | HC.SH30396.02 | HEK293 maintenance |
Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence |
D-Biotin | Sigma | B4639 | BDNF monobiotinylation buffer |
Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
DMEM High Glucose Medium | Gibco | 11965-092 | Neuron seeding |
DMEM Medium | Gibco | 11995-081 | HEK293 maintenance |
Econo Column Funnel | BioRad | 7310003 | Chromatography apparatus component |
EDTA | Merck | 108418 | |
EZ-ECL Kit | Biological Industries | 1633664 | Protein detection by western blotting |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | Neuron and HEK293 maintenance |
Glycerol | Merck | 104094 | BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays |
Hettich Rotina 46R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for clearing the medium of debris |
Hettich Universal 32R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for protein concentrator centrifugation |
Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Neuron seeding |
ImageQuant LAS 500 | GE Healthcare Life Sciences | 29005063 | Western blot image acquisition |
Imidazole | Sigma | I55513 | BDNF buffer modification component |
KCl | Winkler | BM-1370 | PBS component |
KH2PO4 | Merck | 104873 | PBS component |
Laminin | Invitrogen | 23017-015 | Cover coating for compartmentalized neurons |
Luer Tubing Adaptor | BioRad | 7323245 | Chromatography apparatus component |
Luminata™ Forte Western HRP Substrate | Millipore | WBLUF0100 | Protein detection by western blotting |
Mg(CH3COO)2 | Merck | 105819 | BDNF monobiotinylation buffer |
Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | Mounting reagent for immunofluorescence assays |
MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads | Invitrogen | 65001 | Biotinylation verification |
Na2HPO4 | Merck | 106586 | BDNF buffer modification component |
NaCl | Winkler | BM-1630 | PBS component, BDNF buffer modification component |
NaH2PO4 | Merck | 106346 | BDNF buffer modification component |
Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Neuron maintenance |
Ni-NTA Agarose Beads | Qiagen | 30210 | BDNF AviTag purification |
Nikon Ti2-E | Nikon | Microscope for fluorescence imaging | |
Nitrocellulose Membrane | BioRad | 1620115 | Protein transfer for western blotting |
ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | Camera for epifluorescence imaging |
P8340 Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | BDNF buffer modification component |
Paraformaldehyde | Merck | 104005 | Fixative for immunofluorescence assays |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Neuron maintenance |
Poli-D-Lysine | Corning | DLW354210 | Cover coating for compartmentalized neurons |
Poli-L-Lysine | Millipore | P2363 | Cover coating for non-compartmentalized neurons |
Poly-Prep Chromatography Column | BioRad | 7311550 | Chromatography apparatus component |
Polyethyleneimine 25K | Polysciences Inc. | PLY-0296 | HEK293 transfection |
Quantum Dots 655 streptavidin conjugate | Invitrogen | Q10121MP | Monobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments |
Saponin | Sigma | S4521 | Detergent for immunofluorescence assays |
Sucrose | Merck | 107687 | |
Syldgard 184 silicone elastomer base | Poirot | 4019862 | Microfluidic chamber preparation |
TEMED | Sigma | T9281 | SDS-PAGE gel preparation |
Tris | Winkler | BM-2000 | Lysis buffer component |
Triton X100 | Merck | 108603 | Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays |
Trypsin-EDTA 0.5% | Gibco | 15400-054 | HEK293 passaging |