절제된 마우스 티비알 신경에 있는 신경필라멘트 수송의 화상 진찰 그리고 분석
Summary
우리는 광액성 신경필라멘트 단백질을 표현하는 형광성 광섬유 단백질을 표현하는 형광성 광섬유 단백질을 표현하는 형질성 광섬유 마우스에서 말초 신경의 단일 골수축축에서 신경필라멘트의 축산수송을 분석하는 방법을 설명합니다.
Abstract
Neurofilament 단백질 폴리머는 일평균 ~ 0.35-3.5 mmmm의 속도로 축산 수송의 느린 성분에서 축축을 따라 움직입니다. 최근까지 이 운동의 연구는 방사성 이소토피맥 라벨링을 사용하여 가능했으며, 이는 며칠간의 시간적 해상도와 밀리미터의 공간 해상도로 전체 신경에서 축산 수송을 분석할 수 있게 해주였습니다. 더 높은 시간적 및 공간 해상도로 신경 필라멘트 수송을 연구하기 위해, 우리는 뉴런에서 광액표 GFP로 태그 신경 필라멘트 단백질 M을 표현하는 hThy1-paGFP-NFM 형질 성 마우스를 개발했습니다. 여기서우리는 이러한 마우스 ex vivo로부터의 한 골수염 축삭에서 신경필라멘트 수송을 분석하기 위해 형광활성화 펄스 탈출 및 펄스 확산 방법을 설명한다. 고립 된 신경 세그먼트는 산소식염수와 관류에 의해 현미경 단계에서 유지되고 디스크 공초점 형광 현미경 을 회전하여 이미지화됩니다. 보라색 빛은 짧은 축축절 창에서 형광을 활성화하는 데 사용됩니다. 활성화 및 측면 영역의 형광은 시간이 지남에 따라 분석되어 분 및 미크론 순서에 대한 시간적 및 공간 해상도로 신경 필라멘트 수송 연구를 허용합니다. 수학 모델링은 결과 데이터에서 속도, 방향 편향 및 일시 중지 동작을 포함하여 neurofilament 전송의 운동 매개 변수를 추출하는 데 사용할 수 있습니다. 펄스 탈출 및 펄스 확산 방법은 또한 그밖 신경에 있는 신경 필라멘트 수송을 시각화하기 위하여 적응될 수 있습니다. 추가 형질 전환 마우스의 발달로, 이 방법은 또한 착상에 있는 그밖 사이토스켈레탈 및 세포경 단백질의 축축한 수송을 심상 하고 분석하기 위하여 이용될 수 있었습니다.
Introduction
신경필라멘트의 축축 전달은 1970년대에 방사성 이소성 맥박 라벨링1에의해 처음 입증되었다. 이 접근법은 생체 내에서 신경 필라멘트 수송에대한 풍부한 정보를 산출했지만, 일반적으로 밀리미터와 일의 순서에 상대적으로 낮은 공간 및 시간적 해상도를 갖는다2. 더욱이, 방사성 동위원소 펄스 라벨링은 단일 시간 과정을 생성하기 위해 여러 동물의 주사와 희생을 요구하는 간접적인 접근법이다. 1990년대에 형광성 단백질의 발견과 형광 현미경 검사법의 발전으로, 이후 초 또는 분 의 시간 척도및 서브 마이크로미터 공간 해상도로 배양 된 뉴런에서 직접 신경 필라멘트 수송을 이미지화하여 운동3의메커니즘에 훨씬 더 큰 통찰력을 제공하게되었습니다. 이러한 연구는 축축산에 신경 필라멘트 폴리머가 미세 투튜룰 모터 단백질에 의해 추진 된 마이크로 투룰 트랙을 따라 영양 및 역행 방향 모두에서 신속하고 간헐적으로 이동한다는 것을 밝혔습니다. 그러나, 신경필라멘트는 수십 나노미터에 의해 그들의 이웃에서 떨어져 일반적으로 간격을 둔 직경에 다만 10 nm의 회절 제한 구조물입니다; 따라서, 중합체는 이동 폴리머가이웃4로부터해결될 수 있도록 드물게 분산된 신경필라멘트를 포함하는 배양된 뉴런에서만 추적될 수 있다. 따라서, 골수염축산축산과 같은 풍부한 신경필라멘트 폴리머를 함유한 축축에서 단일 신경필라멘트를 추적할 수 없다.
형광 현미경을 이용한 신경필라멘트-풍부한 축산에서 신경필라멘트의 축축수송을 분석하기 위해, 배양된신경세포4,,5에서신경필라멘트의 장기 일시 중지 동작을 연구하기 위해 개발한 형광활성화 펄스-이스케이프 방법을 사용하고 있다. 광액활성 형광 성 신경필라멘트 융합 단백질로 태그된 신경필라멘트는 축종의 짧은 세그먼트에서 활성화되고, 활성화된 부위로부터의 필라멘트의 이탈 속도는 시간이 지남에 따라 형광 부패를 측정하여 정량화된다. 이 접근법의 장점은 개별 신경필라멘트 폴리머의 움직임을 추적할 필요 없이 시간 척도에 적용될 수 있는 신경필라멘트 수송의 인구 수준 분석이라는 것입니다. 예를 들어, 우리는 골수 배양6에서신경 필라멘트 수송의 운동을 분석하기 위해이 방법을 사용했다.
최근에는 인간 뉴런 특이적 Thy1 프로모터7의통제 하에 뉴런에서 paGFP 태그된 신경필라멘트 단백질 M(paGFP-NFM)의 낮은 수준을 표현하는 hThy1-paGFP-NFM 형질전환 마우스의 개발을 설명했다. 이 마우스는 형광 현미경 검사를 사용하여 시상에서 신경 필라멘트 수송의 분석을 허용합니다. 이 문서에서는, 우리는 2개의 접근을 사용하여 이 마우스에서 양철 신경의 골수화한 축소에 있는 신경필라멘트 수송을 분석하기 위한 실험적인 접근을 기술합니다. 이러한 접근법의 첫 번째는 위에서 설명한 펄스 이스케이프 방법입니다. 이 방법은 신경필라멘트의 일시 중지 동작에 대한 정보를 생성할 수 있지만 필라멘트가 활성화된 영역을 출발하는 방향으로 눈이 멀어 순 방향성 및 수송 속도8의측정을 허용하지 않는다. 이러한 접근법의 두 번째는 활성화된 영역에서형광손실뿐만 아니라 형광필라멘트가 전방 및 역행 방향으로 활성화된 영역을 떠날 때 이동하는 두 개의 측면 창에서 형광의 일시적인 증가를 분석하는 새로운 펄스 확산 방법입니다. 두 가지 접근법 모두에서 평균 속도, 순 방향성 및 일시 중지 동작과 같은 신경 필라멘트 수송의 매개 변수는 측정 창에서 형광변화의 변화에 대한 수학적 분석 및 모델링을 사용하여 얻을 수 있습니다. 그림 3은 이 두 가지 방법을 보여 줍니다.
이 프로토콜은 ImageJ9의FIJI 분포 패키지를 사용하여 획득 된 이미지에서 paGFP 형광의 신경 의 해부 및 제조, 활성화 및 이미징, 및 신경 필라멘트 수송의 정량화를 보여줍니다. 우리는 긴 (몇 cm)이며 분기하지 않기 때문에 경골 신경을 사용합니다. 그러나, 원칙적으로 paGFP-NFM을 표현하는 신경은 축축을 손상시키지 않고 해부되고 탈피될 수 있는 경우에 이 기술로 사용하기에 적합합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
주로 평평한 필드 보정, 이미지 정렬 및 표백제 교정 중에 후처리 중에 오류가 발생할 가능성이 크므로 펄스 이스케이프 및 펄스 확산 실험의 분석에 주의를 기울여야 합니다. 평지 보정은 조명의 비 균일성을 보정하는 데 필요하며, 이로 인해 중심에서 주변까지 시야 를 가로질러 강도가 떨어집니다. 비균일성의 정도는 파장에 의존하므로, 항상 실험 데이터를 획득하는 데 사용되는 파장에서 수?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 공초점 현미경 검사법과 정경 신경 해부와 박사 아츠코 우치다, 클로이 듀거와 사나 차한데 마우스 축산에 대한 도움을 폴라 몬스마에 감사드립니다. 이 작품은 A.B에 공동 국가 과학 재단 보조금 IOS1656784에 의해 부분적으로 지원되었다. 그리고 IOS1656765 에 P.J., 및 건강 보조금 R01 NS038526, P30 NS104177 및 S10 OD010383 에 A.B. N.P.B. 오하이오 주립 대학 총장의 박사 후 학자 프로그램에서 펠로우십에 의해 지원되었다.
Materials
| 14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm | Bioptechs | 1907-1422-100 | inner gasket |
| 2-deoxy-D-glucose | Sigma | D6134 | |
| 30mm Round Gasket w/ Holes | Bioptechs | 1907-08-750 | outer gasket |
| 35 x 10mm dish | Thermo Fisher | 153066 | dissection dishes |
| 40mm round coverslips | Bioptechs | 40-1313-0319 | |
| 60mL syringe – Luer-lock tip | BD | 309653 | |
| Andor Revolution WD spinning-disk confocal system | Andor | outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems | |
| Calcium chloride | Fisher | C79 | |
| Coverslips | Fisher | 12-541-B | for fluorescein slide |
| D-(+)-glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26001-70 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | fine tipped forceps |
| Dissection microscope | Zeiss | 47 50 03 | |
| Dissection pan with wax | Ginsberg Scientific | 568859 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | initial dissection scissors |
| FCS2 perfusion chamber | Bioptechs | 060319-2-03 | |
| Fluorescein sodium | Fluka | 46960 | |
| Inline solution heater | Warner Instruments | SH27-B | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | initial dissection forceps |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microaqueduct slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | for fluorescein slide |
| Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | I-3017 | |
| Objective heater system | Okolab | Oko Touch with objective collar | |
| Objective oil – type A | Nikon | discontinued | |
| Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective | Nikon | MRD01901 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium iodoacetate | Sigma-Aldrich | I2512 | |
| Syringe pump | Sage Instruments | Model 355 | |
| Tubing adapter – female | Small Parts Inc. | 1005109 | |
| Tubing adapter – male | Small Parts Inc. | 1005012 | |
| Tygon tubing | Bioptechs | 1/16" ID, 1/32" wall thickness | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | fine scissors |
References
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