Imagerie et analyse du transport neurofilament dans le nerf tibial de souris excisée
Summary
Nous décrivons des méthodes de photoactivation de fluorescence pour analyser le transport axonal des neurofilaments dans les axones myélinis simples des nerfs périphériques des souris transgéniques qui expriment une protéine de neurofilament photoactivatable.
Abstract
Les polymères protéiques neurofilaments se déplacent le long des axones dans la composante lente du transport axonal à des vitesses moyennes de ~0,35-3,5 mm/jour. Jusqu’à récemment, l’étude de ce mouvement in situ n’était possible qu’à l’aide de l’étiquetage radioisotopique des impulsions, ce qui permet l’analyse du transport axonal dans des nerfs entiers avec une résolution temporelle des jours et une résolution spatiale de millimètres. Pour étudier le transport de neurofilament in situ avec une résolution temporelle et spatiale plus élevée, nous avons développé une souris transgénique hThy1-paGFP-NFM qui exprime la protéine de neurofilament M marquée avec le GFP photoactivatable dans les neurones. Ici, nous décrivons la photoactivation de la fluorescence impulsion-évasion et les méthodes de propagation des impulsions pour analyser le transport neurofilament dans les axones myélins uniques des nerfs tibiaux de ces souris ex vivo. Les segments nerveux isolés sont maintenus au stade du microscope par perfusion avec saline oxygénée et photographiés par la microscopie confocale de fluorescence de disque tournant. La lumière violette est utilisée pour activer la fluorescence dans une courte fenêtre axonale. La fluorescence dans les régions activées et flanquantes est analysée au fil du temps, permettant l’étude du transport de neurofilament avec résolution temporelle et spatiale de l’ordre des minutes et des microns, respectivement. La modélisation mathématique peut être utilisée pour extraire les paramètres cinétiques du transport neurofilament, y compris la vitesse, le biais directionnel et le comportement de pause des données résultantes. Les méthodes d’évacuation des impulsions et de propagation du pouls peuvent également être adaptées pour visualiser le transport de neurofilament dans d’autres nerfs. Avec le développement de souris transgéniques supplémentaires, ces méthodes pourraient également être utilisées pour l’image et l’analyse du transport axonal d’autres protéines cytosquelettiques et cytosoliques dans les axones.
Introduction
Le transport axonal des neurofilaments a été démontré pour la première fois dans les années 1970 par l’étiquetage radioisotopique1. Cette approche a donné une mine d’informations sur le transport neurofilament in vivo, mais il a relativement faible résolution spatiale et temporelle, généralement de l’ordre des millimètres et des jours au mieux2. De plus, l’étiquetage radioisotopique des impulsions est une approche indirecte qui nécessite l’injection et le sacrifice de plusieurs animaux pour générer un cours unique. Avec la découverte de protéines fluorescentes et les progrès de la microscopie de fluorescence dans les années 1990, il est devenu par la suite possible d’imager le transport de neurofilament directement dans les neurones cultivés sur une échelle de temps de secondes ou de minutes et avec une résolution spatiale sous-micrométrique, offrant une compréhension beaucoup plus grande du mécanisme du mouvement3. Ces études ont révélé que les polymères neurofilament dans les axones se déplacent rapidement et par intermittence dans les deux directions antérogrades et rétrogrades le long des voies de microtubule, propulsés par des protéines motrices microtubules. Cependant, les neurofilaments sont des structures limitées par la diffraction à seulement 10 nm de diamètre qui sont généralement espacées de leurs voisins par seulement des dizaines de nanomètres; par conséquent, les polymères ne peuvent être suivis que dans les neurones cultivés qui contiennent des neurofilaments peu distribués afin que les polymères en mouvement puissent être résolus à partir de leurs voisins4. Ainsi, il n’est pas actuellement possible de suivre les neurofilaments simples dans les axones qui contiennent des polymères neurofilament abondants, tels que les axones myélins.
Pour analyser le transport axonal des neurofilaments dans les axones riches en neurofilament à l’aide de la microscopie de fluorescence, nous utilisons une méthode de photoactivation de la fluorescence impulsion-évasion que nous avons développée pour étudier le comportement de pause à long terme des neurofilaments dans les cellules nerveuses cultivées4,5. Les neurofilaments marqués avec une protéine de fusion de neurofilament fluorescent photoactivatable sont activés dans un court segment d’axone, puis le taux de départ de ces filaments de la région activée est quantifié en mesurant la décomposition de fluorescence au fil du temps. L’avantage de cette approche est qu’il s’agit d’une analyse au niveau de la population du transport neurofilament qui peut être appliquée sur une échelle de temps de minutes ou d’heures sans avoir besoin de suivre le mouvement des polymères neurofilament individuels. Par exemple, nous avons utilisé cette méthode pour analyser la cinétique du transport neurofilament dans les cultures myélinantes6.
Récemment, nous avons décrit le développement d’une souris transgénique hThy1-paGFP-NFM qui exprime de faibles niveaux d’une protéine de neurofilament pagFP-marquée M (paGFP-NFM) dans les neurones sous le contrôle du neurone humain spécifique Thy1 promoteur7. Cette souris permet l’analyse du transport de neurofilament in situ à l’aide de la microscopie de fluorescence. Dans cet article, nous décrivons les approches expérimentales pour analyser le transport de neurofilament dans les axones myélinés des nerfs tibiaux de ces souris utilisant deux approches. La première de ces approches est la méthode d’évacuation des impulsions décrite ci-dessus. Cette méthode peut générer des informations sur le comportement de pause des neurofilaments, mais est aveugle à la direction dans laquelle les filaments quittent la région activée, et ne permet donc pas la mesure de la directionnalité nette et la vitesse de transport8. La deuxième de ces approches est une nouvelle méthode de propagation des impulsions dans laquelle nous analysons non seulement la perte de fluorescence de la région activée, mais aussi l’augmentation transitoire de la fluorescence dans deux fenêtres latérales par lesquelles les filaments fluorescents se déplacent à mesure qu’ils quittent la région activée dans les deux directions antérogrades et rétrogrades. Dans les deux approches, les paramètres du transport de neurofilament tels que la vitesse moyenne, la directionnalité nette et le comportement de pause peuvent être obtenus en utilisant l’analyse mathématique et la modélisation des changements dans la fluorescence dans les fenêtres de mesure. La figure 3 illustre ces deux approches.
Ce protocole démontre la dissection et la préparation du nerf, l’activation et l’imagerie de la fluorescence paGFP, et la quantification du transport de neurofilament à partir des images acquises à l’aide du paquet de distribution FIJI d’ImageJ9. Nous utilisons le nerf tibial parce qu’il est long (plusieurs cm) et ne se ramifie pas; cependant, en principe tout nerf exprimant paGFP-NFM est approprié pour une utilisation avec cette technique si elle peut être disséquée et désaissée sans endommager les axones.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il faut faire attention à l’analyse des expériences d’évacuation des impulsions et de propagation des impulsions, car il existe un risque important d’introduction d’erreurs pendant le post-traitement, principalement pendant la correction du champ plat, l’alignement de l’image et la correction de l’eau de Javel. La correction de champ plat est nécessaire pour corriger la non-uniformité dans l’éclairage, ce qui entraîne une chute de l’intensité à travers le champ de vision du centre à la périph…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Paula Monsma pour l’instruction et l’aide à la microscopie confocale et à la dissection des nerfs tibiaux et au Dr Atsuko Uchida, Chloe Dugre et Sana Chahandele pour leur aide pour l’élevage de souris. Ce travail a été soutenu en partie par la collaboration De la National Science Foundation Grants IOS1656784 à A.B. et IOS1656765 à P.J., et national Institutes of Health Grants R01 NS038526, P30 NS104177 et S10 OD010383 à A.B. N.P.B. a été soutenu par une bourse de l’Ohio State University President’s Postdoctoral Scholars Program.
Materials
| 14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm | Bioptechs | 1907-1422-100 | inner gasket |
| 2-deoxy-D-glucose | Sigma | D6134 | |
| 30mm Round Gasket w/ Holes | Bioptechs | 1907-08-750 | outer gasket |
| 35 x 10mm dish | Thermo Fisher | 153066 | dissection dishes |
| 40mm round coverslips | Bioptechs | 40-1313-0319 | |
| 60mL syringe – Luer-lock tip | BD | 309653 | |
| Andor Revolution WD spinning-disk confocal system | Andor | outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems | |
| Calcium chloride | Fisher | C79 | |
| Coverslips | Fisher | 12-541-B | for fluorescein slide |
| D-(+)-glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26001-70 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | fine tipped forceps |
| Dissection microscope | Zeiss | 47 50 03 | |
| Dissection pan with wax | Ginsberg Scientific | 568859 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | initial dissection scissors |
| FCS2 perfusion chamber | Bioptechs | 060319-2-03 | |
| Fluorescein sodium | Fluka | 46960 | |
| Inline solution heater | Warner Instruments | SH27-B | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | initial dissection forceps |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microaqueduct slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | for fluorescein slide |
| Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | I-3017 | |
| Objective heater system | Okolab | Oko Touch with objective collar | |
| Objective oil – type A | Nikon | discontinued | |
| Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective | Nikon | MRD01901 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium iodoacetate | Sigma-Aldrich | I2512 | |
| Syringe pump | Sage Instruments | Model 355 | |
| Tubing adapter – female | Small Parts Inc. | 1005109 | |
| Tubing adapter – male | Small Parts Inc. | 1005012 | |
| Tygon tubing | Bioptechs | 1/16" ID, 1/32" wall thickness | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | fine scissors |
References
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