उत्पादित माउस टिबियल नर्व में न्यूरोफिलमेंट परिवहन की इमेजिंग और विश्लेषण
Summary
हम ट्रांसजेनिक चूहों से परिधीय नसों के एकल myelinated axons में न्यूरोफिलमेंट के अक्षीय परिवहन का विश्लेषण करने के लिए फ्लोरेसेंस फोटोएक्टिवेशन विधियों का वर्णन करते हैं जो एक फोटोएक्टिवेट न्यूरोफिलामेंट प्रोटीन व्यक्त करते हैं।
Abstract
न्यूरोफिलामेंट प्रोटीन पॉलिमर ~ 0.35-3.5 मिमी/दिन की औसत गति से अक्षीय परिवहन के धीमे घटक में अक्षों के साथ चलते हैं। हाल ही में जब तक सीटू में इस आंदोलन का अध्ययन केवल रेडियोआइसोटोपिक पल्स-लेबलिंग का उपयोग करके संभव था, जो दिनों के लौकिक संकल्प और मिलीमीटर के स्थानिक संकल्प के साथ पूरी नसों में अक्षीय परिवहन के विश्लेषण की अनुमति देता है। उच्च लौकिक और स्थानिक संकल्प के साथ सीटू में न्यूरोफिलामेंट परिवहन का अध्ययन करने के लिए, हमने एक hThy1-paGFP-NFM ट्रांसजेनिक माउस विकसित किया जो न्यूरॉन्स में फोटोएक्टिवेट जीएफपी के साथ टैग किए गए न्यूरोफिलामेंट प्रोटीन एम को व्यक्त करता है। यहां हम इन चूहों पूर्व वीवोसे टिबियल नसों के एकल माइलिनेटेड एक्सॉन में न्यूरोफिलामेंट परिवहन का विश्लेषण करने के लिए फ्लोरेसेंस फोटोएक्टिवेशन पल्स-एस्केप और पल्स-स्प्रेड विधियों का वर्णन करते हैं। आइसोलेटेड तंत्रिका खंडों को माइक्रोस्कोप चरण पर ऑक्सीजनयुक्त खारा के साथ परफ्यूजन द्वारा बनाए रखा जाता है और डिस्क कंफोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी कताई द्वारा चित्रित किया जाता है। वायलेट लाइट का उपयोग एक छोटी अक्षीय खिड़की में फ्लोरेसेंस को सक्रिय करने के लिए किया जाता है। सक्रिय और फ्लैंकिंग क्षेत्रों में फ्लोरेसेंस का विश्लेषण समय के साथ किया जाता है, जो क्रमशः मिनट और माइक्रोन के क्रम पर लौकिक और स्थानिक संकल्प के साथ न्यूरोफिलामेंट परिवहन के अध्ययन की अनुमति देता है। गणितीय मॉडलिंग का उपयोग न्यूरोफिलामेंट परिवहन के गतिज मापदंडों को निकालने के लिए किया जा सकता है जिसमें वेग, दिशात्मक पूर्वाग्रह और परिणामस्वरूप डेटा से रुके हुए व्यवहार शामिल हैं। नाड़ी-भागने और नाड़ी फैलाने के तरीकों को अन्य नसों में न्यूरोफिलामेंट परिवहन की कल्पना करने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है। अतिरिक्त ट्रांसजेनिक चूहों के विकास के साथ, इन तरीकों का उपयोग एक्सॉन में अन्य साइटोस्केलेल और साइटोसोलिक प्रोटीन के अक्षीय परिवहन को छवि और विश्लेषण करने के लिए भी किया जा सकता है।
Introduction
न्यूरोफिलामेंट्स के अक्षीय परिवहन को पहली बार 1 9 70 के दशक में रेडियोआइसोटोपिक पल्स-लेबलिंग1द्वारा प्रदर्शित किया गया था। इस दृष्टिकोण ने वीवो मेंन्यूरोफिलामेंट परिवहन के बारे में जानकारी का खजाना प्राप्त किया है, लेकिन इसमें अपेक्षाकृत कम स्थानिक और लौकिक संकल्प होता है, आमतौर पर मिलीमीटर और दिनों के क्रम पर सबसे अच्छा2। इसके अलावा, रेडियोआइसोटोपिक पल्स-लेबलिंग एक अप्रत्यक्ष दृष्टिकोण है जिसके लिए एक ही समय पाठ्यक्रम उत्पन्न करने के लिए कई जानवरों के इंजेक्शन और बलिदान की आवश्यकता होती है। 1 99 0 के दशक में फ्लोरोसेसेंस माइक्रोस्कोपी में फ्लोरोसेंट प्रोटीन और प्रगति की खोज के साथ, बाद में कैलिफ़ोर्निया या मिनटों के समय पैमाने पर और उप-सूक्ष्म स्थानिक संकल्प के साथ, आंदोलन3के तंत्र में बहुत अधिक अंतर्दृष्टि प्रदान करते हुए, सुसंस्कृत न्यूरॉन्स में सीधे न्यूरोफिलामेंट परिवहन की छवि संभव हो गई। इन अध्ययनों से पता चला है कि एक्सॉन में न्यूरोफिलामेंट पॉलिमर माइक्रोट्यूबुल मोटर प्रोटीन द्वारा चालित माइक्रोट्यूबुले पटरियों के साथ एंटीरोग्रेड और प्रतिगामी दोनों दिशाओं में तेजी से और रुक-रुककर आगे बढ़ते हैं। हालांकि, न्यूरोफिलामेंट्स डिफेक्शन-लिमिटेड संरचनाएं हैं जो व्यास में सिर्फ 10 एनएम हैं जो आमतौर पर केवल दसियों नैनोमीटर से अपने पड़ोसियों से अलग होती हैं; इसलिए, पॉलिमर केवल सुसंस्कृत न्यूरॉन्स में ट्रैक किया जा सकता है जिसमें विरल वितरित न्यूरोफिलामेंट्स होते हैं ताकि चलती पॉलिमर को उनके पड़ोसियों से हल किया जा सके4. इस प्रकार, वर्तमान में एक्सॉन में एकल न्यूरोफिलामेंट को ट्रैक करना संभव नहीं है जिसमें प्रचुर मात्रा में न्यूरोफिलामेंट पॉलिमर होते हैं, जैसे कि माइलिनेटेड एक्सॉन।
फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके न्यूरोफिलामेंट से भरपूर एक्सोन में न्यूरोफिलामेंट के अक्षीय परिवहन का विश्लेषण करने के लिए, हम फ्लोरेसेंस फोटोएक्टिवेशन पल्स-एस्केप विधि का उपयोग करते हैं जिसे हमने सुसंस्कृत तंत्रिका कोशिकाओं4,,5में न्यूरोफिलामेंट के दीर्घकालिक ठहराव व्यवहार का अध्ययन करने के लिए विकसित किया। एक फोटोएक्टिवेबल फ्लोरोसेंट न्यूरोफिलामेंट फ्यूजन प्रोटीन के साथ टैग किए गए न्यूरोफिलामेंट्स को एक्सॉन के एक छोटे खंड में सक्रिय किया जाता है, और फिर सक्रिय क्षेत्र से उन फिलामेंट्स के प्रस्थान की दर समय के साथ फ्लोरेसेंस क्षय को मापने के द्वारा निर्धारित की जाती है। इस दृष्टिकोण का लाभ यह है कि यह न्यूरोफिलामेंट परिवहन का जनसंख्या स्तर का विश्लेषण है जिसे व्यक्तिगत न्यूरोफाइलमेंट पॉलिमर के आंदोलन को ट्रैक करने की आवश्यकता के बिना मिनटों या घंटों के समय-पैमाने पर लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, हमने इस विधि का उपयोग माइलिनिंग संस्कृतियों में न्यूरोफिलामेंट परिवहन के काइनेटिक्स का विश्लेषण करने के लिए किया है6.
हाल ही में, हमने मानव न्यूरॉन-विशिष्ट Thy1 प्रमोटर7के नियंत्रण में न्यूरॉन्स में एक पगएफपी-टैग न्यूरोफिलामेंट प्रोटीन एम (paGFP-NFM) के निम्न स्तर को व्यक्त करने वाले एक hThy1-paGFP-NFM ट्रांसजेनिक माउस के विकास का वर्णन किया। यह माउस फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सीटू में न्यूरोफिलमेंट परिवहन के विश्लेषण की अनुमति देता है। इस लेख में, हम दो दृष्टिकोणों का उपयोग करके इन चूहों से टिबियल नसों के माइलिनेटेड एक्सॉन में न्यूरोफिलमेंट परिवहन का विश्लेषण करने के लिए प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों का वर्णन करते हैं। इन दृष्टिकोणों में से पहला ऊपर वर्णित नाड़ी-एस्केप विधि है। यह विधि न्यूरोफिलामेंट्स के रुके हुए व्यवहार के बारे में जानकारी उत्पन्न कर सकती है, लेकिन उस दिशा में अंधा है जिसमें तंतुओं सक्रिय क्षेत्र को विदा करते हैं, और इसलिए शुद्ध दिशात्मकता और परिवहन वेग8के माप की अनुमति नहीं देता है। इन दृष्टिकोणों में से दूसरा एक नई नाड़ी-प्रसार विधि है जिसमें हम न केवल सक्रिय क्षेत्र से फ्लोरेसेंस के नुकसान का विश्लेषण करते हैं, बल्कि दो फ्लैंकिंग खिड़कियों में फ्लोरेसेंस में क्षणिक वृद्धि भी करते हैं जिसके माध्यम से फ्लोरोसेंट फिलामेंट्स आगे बढ़ते हैं क्योंकि वे एंथोग्रेड और प्रतिगामी दोनों दिशाओं में सक्रिय क्षेत्र को विदा करते हैं। दोनों दृष्टिकोणों में, माप खिड़कियों में फ्लोरेसेंस में परिवर्तन के गणितीय विश्लेषण और मॉडलिंग का उपयोग करके औसत वेग, शुद्ध दिशात्मकता और रुके हुए व्यवहार जैसे न्यूरोफिलमेंट परिवहन के मापदंडों को प्राप्त किया जा सकता है। चित्रा 3 इन दो दृष्टिकोणों को दिखाता है।
यह प्रोटोकॉल पगप्लोसुरेंस की तंत्रिका, सक्रियण और इमेजिंग के विच्छेदन और तैयारी को दर्शाता है, और इमेजजे9के फिजी वितरण पैकेज का उपयोग करके अधिग्रहीत छवियों से न्यूरोफिलामेंट परिवहन का मात्राकरण करता है। हम टिबियल तंत्रिका का उपयोग करते हैं क्योंकि यह लंबा (कई सेमी) है और शाखा नहीं करता है; हालांकि, सैद्धांतिक रूप से paGFP-NFM व्यक्त करने वाली कोई भी तंत्रिका इस तकनीक के साथ उपयोग के लिए उपयुक्त है यदि इसे अक्षतंख को नुकसान पहुंचाए बिना विच्छेदित और डी-म्यान किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
नाड़ी-भागने और नाड़ी-प्रसार प्रयोगों के विश्लेषण में देखभाल की जानी चाहिए क्योंकि प्रसंस्करण के बाद, मुख्य रूप से फ्लैट-फील्ड सुधार, छवि संरेखण और ब्लीच सुधार के दौरान त्रुटि की शुरुआत के लिए महत्वपूर…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक ों को अनुदेश और सहायता के लिए पाउला Monsma धन्यवाद देना चाहते हैं, साथ ही कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और टिबियल तंत्रिका विच्छेदन और डॉ अत्सुको उचिदा, च्लोए डुगर और सना चहांदे के साथ माउस पशुपालन के साथ सहायता के लिए सहायता के लिए । इस काम को सहयोगी नेशनल साइंस फाउंडेशन ग्रांट IOS1656784 से एबी तक के हिस्से में समर्थन मिला । और IOS1656765 पीजे के लिए, और स्वास्थ्य अनुदान R01 NS038526, P30 NS104177 और S10 OD010383 को A.B. N.P.B. को ओहियो राज्य विश्वविद्यालय के अध्यक्ष के पोस्टडॉक्टर स्कॉलर्स प्रोग्राम से फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| 14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm | Bioptechs | 1907-1422-100 | inner gasket |
| 2-deoxy-D-glucose | Sigma | D6134 | |
| 30mm Round Gasket w/ Holes | Bioptechs | 1907-08-750 | outer gasket |
| 35 x 10mm dish | Thermo Fisher | 153066 | dissection dishes |
| 40mm round coverslips | Bioptechs | 40-1313-0319 | |
| 60mL syringe – Luer-lock tip | BD | 309653 | |
| Andor Revolution WD spinning-disk confocal system | Andor | outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems | |
| Calcium chloride | Fisher | C79 | |
| Coverslips | Fisher | 12-541-B | for fluorescein slide |
| D-(+)-glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26001-70 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | fine tipped forceps |
| Dissection microscope | Zeiss | 47 50 03 | |
| Dissection pan with wax | Ginsberg Scientific | 568859 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | initial dissection scissors |
| FCS2 perfusion chamber | Bioptechs | 060319-2-03 | |
| Fluorescein sodium | Fluka | 46960 | |
| Inline solution heater | Warner Instruments | SH27-B | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | initial dissection forceps |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microaqueduct slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | for fluorescein slide |
| Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | I-3017 | |
| Objective heater system | Okolab | Oko Touch with objective collar | |
| Objective oil – type A | Nikon | discontinued | |
| Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective | Nikon | MRD01901 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium iodoacetate | Sigma-Aldrich | I2512 | |
| Syringe pump | Sage Instruments | Model 355 | |
| Tubing adapter – female | Small Parts Inc. | 1005109 | |
| Tubing adapter – male | Small Parts Inc. | 1005012 | |
| Tygon tubing | Bioptechs | 1/16" ID, 1/32" wall thickness | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | fine scissors |
References
- Hoffman, P. N., Lasek, R. J. The slow component of axonal transport. Identification of major structural polypeptides of the axon and their generality among mammalian neurons. Journal of Cell Biology. 66 (2), 351-366 (1975).
- Brown, A. Slow Axonal Transport. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2014).
- Wang, L., Ho, C. -. L., Sun, D., Liem, R. K. H., Brown, A. Rapid movement of axonal neurofilaments interrupted by prolonged pauses. Nature Cell Biology. 2 (3), 137-141 (2000).
- Uchida, A., Monsma, P. C., Fenn, J. D., Brown, A. Live-cell imaging of neurofilament transport in cultured neurons. Methods in Cell Biology. 131, 21-90 (2016).
- Trivedi, N., Jung, P., Brown, A. Neurofilaments switch between distinct mobile and stationary states during their transport along axons. Journal of Neuroscience. 27 (3), 507-516 (2007).
- Monsma, P. C., Li, Y., Fenn, J. D., Jung, P., Brown, A. Local regulation of neurofilament transport by myelinating cells. Journal of Neuroscience. 34 (8), 2979-2988 (2014).
- Walker, C. L., et al. Local Acceleration of Neurofilament Transport at Nodes of Ranvier. Journal of Neuroscience. 39 (4), 663-677 (2019).
- Li, Y., Brown, A., Jung, P. Deciphering the axonal transport kinetics of neurofilaments using the fluorescence photoactivation pulse-escape method. Physical Biology. 11 (2), 026001 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Breuer, A. C., et al. Fast axonal transport in amyotrophic lateral sclerosis: an intra-axonal organelle traffic analysis. Neurology. 37 (5), 738-748 (1987).
- Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
- Model, M. Intensity calibration and flat-field correction for fluorescence microscopes. Current Protocols in Cytometry. 68, (2014).
- Schmidt, M. M., Dringen, R. Differential effects of iodoacetamide and iodoacetate on glycolysis and glutathione metabolism of cultured astrocytes. Frontiers in Neuroenergetics. 1, 1-10 (2009).
- Surre, J., et al. Strong increase in the autofluorescence of cells signals struggle for survival. Scientific Reports. 8 (1), 12088 (2018).
- Cox, M., Lucey, S., Sridharan, S., Cohn, J. Least Squares Congealing for Unsupervised Alignment of Images. Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. , (2008).
- Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and flavoprotein. Biophysical Journal. 82 (5), 2811-2825 (2002).
- Fenn, J. D., Johnson, C. M., Peng, J., Jung, P., Brown, A. Kymograph analysis with high temporal resolution reveals new features of neurofilament transport kinetics. Cytoskeleton. 75 (1), 22-41 (2018).
- Alami, N. H., Jung, P., Brown, A. Myosin Va increases the efficiency of neurofilament transport by decreasing the duration of long-term pauses. Journal of Neuroscience. 29 (20), 6625-6634 (2009).
- Xu, Z., Tung, V. W. Temporal and Spatial Variations in Slow Axonal Transport Velocity Along Peripheral Motoneuron Axons. Neurosciences. 102 (1), 193-200 (2001).
- Jung, P., Brown, A. Modeling the Slowing of Neurofilament Transport Along the Mouse Sciatic Nerve. Physical Biology. 6 (4), 046002 (2009).
- Cohen, J. The effect size index: d. Statistical Power Analysis for the Behavioral Sciences 2nd ed. , 20-26 (1988).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nature Methods. 4 (7), 559-561 (2007).
- Gilley, J., et al. Age-dependent axonal transport and locomotor changes and tau hypophosphorylation in a “P301L” tau knockin mouse. Neurobiology of Aging. 33 (3), 1-15 (2012).
- Marinkovic, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 109 (11), 4296-4301 (2012).
- Milde, S., Adalbert, R., Elaman, M. H., Coleman, M. P. Axonal transport declines with age in two distinct phases separated by a period of relative stability. Neurobiology of Aging. 36 (2), 971-981 (2015).
- Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
