Imaging e analisi del trasporto neurofilamento nel nervo tibiale del topo escresato
Summary
Descriviamo i metodi di fotoattivazione della fluorescenza per analizzare il trasporto assonale dei neurofilamenti in assoni singoli mielinati di nervi periferici da topi transgenici che esprimono una proteina neurofilabile fotoattivabile.
Abstract
I polimeri proteici neurofilamenti si muovono lungo gli assoni nella componente lenta del trasporto assonale a velocità medie di 0,35-3,5 mm al giorno. Fino a poco tempo fa lo studio di questo movimento in situ era possibile solo utilizzando l’etichettatura a impulsi radioisotopica, che permette l’analisi del trasporto assonale in nervi interi con una risoluzione temporale di giorni e una risoluzione spaziale di millimetri. Per studiare il trasporto di neurofilamenti in situ con una risoluzione temporale e spaziale più elevata, abbiamo sviluppato un topo transgenico hThy1-paGFP-NFM che esprime la proteina neurofilamento M etichettata con GFP fotoattivabile nei neuroni. Qui descriviamo i metodi di fluorescenza fotoattivazione impulso-fuga e pulsazione-spread per analizzare il trasporto neurofilamento in assoni mielinati singoli di nervi tibiali da questi topi ex vivo. I segmenti nervosi isolati vengono mantenuti sullo stadio del microscopio per perfusione con salina ossigenata e immagini di microscopia a fluorescenza confocale del disco rotante. La luce viola viene utilizzata per attivare la fluorescenza in una breve finestra assonale. La fluorescenza nelle regioni attivate e fiancheggiate viene analizzata nel tempo, permettendo lo studio del trasporto neurofilamento con risoluzione temporale e spaziale rispettivamente nell’ordine dei minuti e dei micron. La modellazione matematica può essere utilizzata per estrarre i parametri cinetici del trasporto neurofilamento, tra cui la velocità, la distorsione direzionale e il comportamento di pausa dai dati risultanti. I metodi di fuga di impulsi e di diffusione del polso possono anche essere adattati per visualizzare il trasporto di neurofilamenti in altri nervi. Con lo sviluppo di topi transgenici aggiuntivi, questi metodi potrebbero anche essere utilizzati per immagini e analisi del trasporto assonale di altre proteine citoscheschescheschesche e citosoliche negli assoni.
Introduction
Il trasporto assonale dei neurofilamenti è stato dimostrato per la prima volta negli anni ’70 mediante l’etichettatura radioisotopica a impulsi1. Questo approccio ha prodotto una ricchezza di informazioni sul trasporto neurofilamento in vivo, ma ha una risoluzione spaziale e temporale relativamente bassa, in genere nell’ordine di millimetri e giorni al meglio2. Inoltre, l’etichettatura radioisotopica degli impulsi è un approccio indiretto che richiede l’iniezione e il sacrificio di più animali per generare un singolo corso di tempo. Con la scoperta delle proteine fluorescenti e i progressi nella microscopia a fluorescenza negli anni ’90, è diventato successivamente possibile immagine del trasporto neurofilamento direttamente nei neuroni ri culture su una scala temporale di secondi o minuti e con risoluzione spaziale sub-micrometrica, offrendo una visione molto maggiore del meccanismo del movimento3. Questi studi hanno rivelato che i polimeri neurofilament negli assoni si muovono rapidamente e ad intermittenza sia in direzioni anterograde che retrograde lungo le tracce di microtubuli, spinte dalle proteine motorie dei microtubuli. Tuttavia, i neurofilamenti sono strutture limitate alla diffrazione di soli 10 nm di diametro che sono tipicamente distanziate dai loro vicini da solo decine di nanometri; pertanto, i polimeri possono essere tracciati solo in neuroni ri culture che contengono neurofilamenti scarsamente distribuiti in modo che i polimeri in movimento possano essere risolti dai loro vicini4. Pertanto, non è attualmente possibile tracciare singoli neurofilamenti in assoni che contengono abbondanti polimeri neurofilament, come gli assoni mielinati.
Per analizzare il trasporto assonale dei neurofilamenti in assoni ricchi di neurofilamenti utilizzando la microscopia a fluorescenza, usiamo un metodo di sfuggimento a impulsi di fotoattivazione fluorescenza che abbiamo sviluppato per studiare il comportamento di pausa a lungo termine dei neurofilamenti nelle cellule nervosepianate 4,5. I neurofilamenti contrassegnati con una proteina di fusione del neurofilamento fluorescente fotoattivabile vengono attivati in un breve segmento di assone, e quindi il tasso di partenza di tali filamenti dalla regione attivata viene quantificato misurando il decadimento della fluorescenza nel tempo. Il vantaggio di questo approccio è che si tratta di un’analisi a livello di popolazione del trasporto neurofilamento che può essere applicata su una scala temporale di minuti o ore senza la necessità di monitorare il movimento dei singoli polimeri neurofilament. Ad esempio, abbiamo usato questo metodo per analizzare la cinetica del trasporto neurofilamento nelle culture mielinanti6.
Recentemente, abbiamo descritto lo sviluppo di un topo transgenico hThy1-paGFP-NFM che esprime bassi livelli di una proteina neurofilamento con tag paGFP M (paGFP-NFM) nei neuroni sotto il controllo del promotore Thy1 specifico del neuroneumano 7. Questo topo permette l’analisi del trasporto di neurofilamenti in situ utilizzando la microscopia a fluorescenza. In questo articolo, descriviamo gli approcci sperimentali per l’analisi del trasporto di neurofilamenti in assoni mielinati di nervi tibiali da questi topi utilizzando due approcci. Il primo di questi approcci è il metodo di fuga a impulsi descritto in precedenza. Questo metodo può generare informazioni sul comportamento di pausa dei neurofilamenti, ma è cieco alla direzione in cui i filamenti lasciano la regione attivata e pertanto non consente la misurazione della direzionalità netta e della velocità ditrasporto 8. Il secondo di questi approcci è un nuovo metodo di diffusione dell’impulso in cui analizziamo non solo la perdita di fluorescenza dalla regione attivata, ma anche l’aumento transitorio della fluorescenza in due finestre di fiancheggiamento attraverso le quali i filamenti fluorescenti si muovono mentre partono dalla regione attivata sia in direzioni anterograde che retrograde. In entrambi gli approcci, i parametri del trasporto neurofilamento come la velocità media, la direzionalità netta e il comportamento di pausa possono essere ottenuti utilizzando l’analisi matematica e la modellazione dei cambiamenti nella fluorescenza nelle finestre di misurazione. Figura 3 illustra questi due approcci.
Questo protocollo dimostra la dissezione e la preparazione del nervo, l’attivazione e l’imaging della fluorescenza paGFP e la quantificazione del trasporto neurofilamento dalle immagini acquisite utilizzando il pacchetto di distribuzione FIJI di ImageJ9. Usiamo il nervo tibiale perché è lungo (diversi cm) e non si ramifica; tuttavia, in linea di principio qualsiasi nervo che esprime paGFP-NFM è appropriato per l’uso con questa tecnica se può essere sezionato e de-tireggiato senza danneggiare gli assoni.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’analisi degli esperimenti di fuga e di diffusione dell’impulso deve essere presa in considerazione perché esiste un potenziale significativo per l’introduzione dell’errore durante la post-elaborazione, principalmente durante la correzione del campo piatto, l’allineamento dell’immagine e la correzione della candeggina. La correzione a campo piatto è necessaria per correggere la non uniformità nell’illuminazione, che si traduce in una caduta di intensità attraverso il campo di vista dal centro alla periferia. L’entit…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Paula Monsma per l’istruzione e l’assistenza con la microscopia confocale e la dissezione dei nervi tibiali e la dottoressa Atsuko Uchida, Chloe Duger e Sana Chahande per l’assistenza con l’allevamento dei topi. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla collaborazione National Science Foundation Grants IOS1656784 ad A.B. e IOS1656765 a P.J., e National Institutes of Health Grants R01 NS038526, P30 NS104177 e S10 OD010383 ad A.B. N.P.B. è stato sostenuto da una borsa di studio del programma Postdoctoral Scholars del Presidente della Ohio State University.
Materials
| 14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm | Bioptechs | 1907-1422-100 | inner gasket |
| 2-deoxy-D-glucose | Sigma | D6134 | |
| 30mm Round Gasket w/ Holes | Bioptechs | 1907-08-750 | outer gasket |
| 35 x 10mm dish | Thermo Fisher | 153066 | dissection dishes |
| 40mm round coverslips | Bioptechs | 40-1313-0319 | |
| 60mL syringe – Luer-lock tip | BD | 309653 | |
| Andor Revolution WD spinning-disk confocal system | Andor | outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems | |
| Calcium chloride | Fisher | C79 | |
| Coverslips | Fisher | 12-541-B | for fluorescein slide |
| D-(+)-glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26001-70 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | fine tipped forceps |
| Dissection microscope | Zeiss | 47 50 03 | |
| Dissection pan with wax | Ginsberg Scientific | 568859 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | initial dissection scissors |
| FCS2 perfusion chamber | Bioptechs | 060319-2-03 | |
| Fluorescein sodium | Fluka | 46960 | |
| Inline solution heater | Warner Instruments | SH27-B | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | initial dissection forceps |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microaqueduct slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | for fluorescein slide |
| Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | I-3017 | |
| Objective heater system | Okolab | Oko Touch with objective collar | |
| Objective oil – type A | Nikon | discontinued | |
| Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective | Nikon | MRD01901 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium iodoacetate | Sigma-Aldrich | I2512 | |
| Syringe pump | Sage Instruments | Model 355 | |
| Tubing adapter – female | Small Parts Inc. | 1005109 | |
| Tubing adapter – male | Small Parts Inc. | 1005012 | |
| Tygon tubing | Bioptechs | 1/16" ID, 1/32" wall thickness | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | fine scissors |
References
- Hoffman, P. N., Lasek, R. J. The slow component of axonal transport. Identification of major structural polypeptides of the axon and their generality among mammalian neurons. Journal of Cell Biology. 66 (2), 351-366 (1975).
- Brown, A. Slow Axonal Transport. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2014).
- Wang, L., Ho, C. -. L., Sun, D., Liem, R. K. H., Brown, A. Rapid movement of axonal neurofilaments interrupted by prolonged pauses. Nature Cell Biology. 2 (3), 137-141 (2000).
- Uchida, A., Monsma, P. C., Fenn, J. D., Brown, A. Live-cell imaging of neurofilament transport in cultured neurons. Methods in Cell Biology. 131, 21-90 (2016).
- Trivedi, N., Jung, P., Brown, A. Neurofilaments switch between distinct mobile and stationary states during their transport along axons. Journal of Neuroscience. 27 (3), 507-516 (2007).
- Monsma, P. C., Li, Y., Fenn, J. D., Jung, P., Brown, A. Local regulation of neurofilament transport by myelinating cells. Journal of Neuroscience. 34 (8), 2979-2988 (2014).
- Walker, C. L., et al. Local Acceleration of Neurofilament Transport at Nodes of Ranvier. Journal of Neuroscience. 39 (4), 663-677 (2019).
- Li, Y., Brown, A., Jung, P. Deciphering the axonal transport kinetics of neurofilaments using the fluorescence photoactivation pulse-escape method. Physical Biology. 11 (2), 026001 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Breuer, A. C., et al. Fast axonal transport in amyotrophic lateral sclerosis: an intra-axonal organelle traffic analysis. Neurology. 37 (5), 738-748 (1987).
- Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
- Model, M. Intensity calibration and flat-field correction for fluorescence microscopes. Current Protocols in Cytometry. 68, (2014).
- Schmidt, M. M., Dringen, R. Differential effects of iodoacetamide and iodoacetate on glycolysis and glutathione metabolism of cultured astrocytes. Frontiers in Neuroenergetics. 1, 1-10 (2009).
- Surre, J., et al. Strong increase in the autofluorescence of cells signals struggle for survival. Scientific Reports. 8 (1), 12088 (2018).
- Cox, M., Lucey, S., Sridharan, S., Cohn, J. Least Squares Congealing for Unsupervised Alignment of Images. Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. , (2008).
- Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and flavoprotein. Biophysical Journal. 82 (5), 2811-2825 (2002).
- Fenn, J. D., Johnson, C. M., Peng, J., Jung, P., Brown, A. Kymograph analysis with high temporal resolution reveals new features of neurofilament transport kinetics. Cytoskeleton. 75 (1), 22-41 (2018).
- Alami, N. H., Jung, P., Brown, A. Myosin Va increases the efficiency of neurofilament transport by decreasing the duration of long-term pauses. Journal of Neuroscience. 29 (20), 6625-6634 (2009).
- Xu, Z., Tung, V. W. Temporal and Spatial Variations in Slow Axonal Transport Velocity Along Peripheral Motoneuron Axons. Neurosciences. 102 (1), 193-200 (2001).
- Jung, P., Brown, A. Modeling the Slowing of Neurofilament Transport Along the Mouse Sciatic Nerve. Physical Biology. 6 (4), 046002 (2009).
- Cohen, J. The effect size index: d. Statistical Power Analysis for the Behavioral Sciences 2nd ed. , 20-26 (1988).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nature Methods. 4 (7), 559-561 (2007).
- Gilley, J., et al. Age-dependent axonal transport and locomotor changes and tau hypophosphorylation in a “P301L” tau knockin mouse. Neurobiology of Aging. 33 (3), 1-15 (2012).
- Marinkovic, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 109 (11), 4296-4301 (2012).
- Milde, S., Adalbert, R., Elaman, M. H., Coleman, M. P. Axonal transport declines with age in two distinct phases separated by a period of relative stability. Neurobiology of Aging. 36 (2), 971-981 (2015).
- Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
