げっ歯類における血液脳関門開口のためのハイスループット画像誘導定型神経ナビゲーションと集中超音波システム
Summary
血液脳関門(BBB)は、マイクロバブル媒介性集中超音波(FUS)で一時的に破壊することができる。ここでは、非超音波専門家がアクセス可能なモジュラーFUSシステムを使用して、高スループットBBBのインビボでの開口のためのステップバイステッププロトコルについて説明する。
Abstract
血液脳関門(BBB)は、様々な脳疾患の治療のための主要なハードルとなっています。狭い接合によって連結された内皮細胞は、大きな分子(>500 Da)が脳組織に入るのを防ぐ生理的障壁を形成する。マイクロバブル媒介型集中超音波(FUS)は、一過性の局所BBB開口部を誘導するために使用することができ、より大きな薬物が脳の気質に入ることを可能にする。
臨床翻訳のための大規模な臨床装置に加えて、薬剤候補の治療応答評価のための前臨床研究は、標的BBB開口部のための専用の小動物超音波セットアップを必要とする。これらのシステムは、高空間精度と統合キャビテーションモニタリングの両方でハイスループットのワークフローを可能にする一方で、初期投資コストとランニングコストの両方でコスト効率が良いものです。
ここでは、市販成分に基づき、前述の要件を満たす生物発光及びX線誘導体系小型動物FUSシステムを提示する。特に、大量の前臨床薬物評価研究で一般的に遭遇する課題を促進する高度な自動化に重点が置かれている。これらの課題の例として、データの再現性を確保し、グループ内変動を低減し、サンプルサイズを削減し、倫理的要件に準拠し、不要な作業負荷を軽減するために標準化が必要です。提案されたBBBシステムは、多形性神経膠芽腫およびびまん性正中性神経膠腫の患者由来異種移植片モデルに対するBBB開封促進薬物送達試験の範囲で検証された。
Introduction
血液脳関門(BBB)は、脳のパレンチマへの薬物送達のための主要な障害です。開発されたほとんどの治療薬は、その物理化学的パラメータ(例えば、親油性、分子量、水素結合アクセプターおよびドナー)のためにBBBを横断しないか、または脳内の流出輸送体に対する親和性のために保持されない1、2。BBBを横断できる薬物の小さなグループは、典型的には小さな親油性分子であり、これは限られた数の脳疾患1,2にのみ有効である。その結果、大多数の脳疾患では、薬理学的治療の選択肢が限られており、新しい薬物送達戦略が3,4に必要である。
治療超音波は、BBB破壊(BBBD)、神経変調、およびアブレーション4、5、6、7などの異なる神経学的用途に使用することができる新たな技術である。頭蓋骨を介して体外超音波エミッタを有するBBB開口部を達成するために、集中超音波(FUS)は、マイクロバブルと組み合わされる。マイクロバブル媒介FUSは、脳のパレンチマ5、8、9における薬物の生物学的利用能の増加をもたらす。音波の存在下では、マイクロバブルがBBBの内皮細胞間の緊密な接合部の開始と破壊を開始し、より大きな分子10の細胞内輸送を可能にする。これまでの研究では、音響放射の強度とBBB開口部11、12、13、14に及ぼす生物学的影響との相関が確認された。FUSは、マイクロバブルと組み合わせて、化学療法剤としてテモゾロミドまたはリポソームドキソルビシンを用いた神経膠芽腫の治療、またはアルツハイマー病および筋萎縮性側索硬化症5、9、15、16の治療に対する臨床試験で既に使用されている。
超音波は、薬物療法のための全く新しい可能性のBBB開口部を介して仲介するので、臨床翻訳のための前臨床研究は、選択された薬物候補の治療応答を評価するために必要とされる。通常、高空間精度の高スループット ワークフローと、高い再現性を備えたターゲット BBB 開口部の監視用の統合キャビテーション検出が必要です。可能であれば、これらのシステムは、研究規模に応じてスケーラブルにするために、初期投資とランニングコストの両方でコスト効率が高い必要があります。ほとんどの前臨床FUSシステムは、画像誘導および治療計画15、17、18、19のためにMRIと組み合わされる。MRIは腫瘍の解剖学と容積に関する詳細な情報を提供するが、それは一般的に訓練を受けた/熟練したオペレータによって行われる高価な技術である。さらに、高精細MRIは、常に前臨床施設の研究者が利用できるとは限らず、動物1匹あたりのスキャン時間が長く必要であり、高スループットの薬理学的研究にはあまり適していません。注目すべきは、神経腫瘍学の分野における前臨床研究、特に浸潤性腫瘍モデルのために、腫瘍を可視化し標的にする可能性が治療の成功20に不可欠である。現在、この要件はMRIまたは光タンパク質を導入した腫瘍によってのみ満たされ、光タンパク質基質の投与と組み合わせて生物発光イメージング(BLI)による可視化を可能にする。
MRI誘導FUSシステムは、多くの場合、経頭蓋適用のための超音波の伝播を確実にするために水浴を使用し、それによって動物の頭部は部分的に水中に沈み、いわゆる’ボトムアップ’システム15、17、18。これらの設計は一般的に小さな動物実験でうまく機能しますが、使用中の動物の準備時間、移植性、現実的に維持可能な衛生基準の間の妥協点です。MRIの代替として、立体的ナビゲーションのための他の誘導方法は、げっ歯類解剖学的アトラス21、22、23、レーザーポインタ支援視覚目撃24、ピンホール支援機械スキャン装置25、またはBLI26の使用を包含する。これらの設計のほとんどは、トランスデューサーが動物の頭の上に置かれ、動物が自然な位置に置かれる「トップダウン」システムです。’トップダウン’のワークフローは、水浴22、25、26または水で満たされたコーン21、24のいずれかで構成されています。閉じたコーンの内部のトランスデューサーを使用することの利点は、よりコンパクトなフットプリント、セットアップ時間の短縮、簡単な除染の可能性がワークフロー全体を簡素化することです。
マイクロバブルとの音響場の相互作用は圧力依存性であり、低振幅振動(安定キャビテーションと呼ばれる)から過渡的な気泡崩壊(慣性キャビテーションと呼ばれる)27,28に及ぶ。超音波BBBDは、BBBDを成功させるために安定キャビテーション閾値をはるかに上回る音響圧力を必要とするが、慣性キャビテーション閾値を下回るが、一般的に血管/神経損傷29に関連しているという確立されたコンセンサスがある。監視および制御の最も一般的な形態は、McDannoldらが示唆する(バック)散乱音響信号の分析である受動的キャビテーション検出(PCD)である。PCDは、安定キャビテーションの特徴(高調波、低調波、超高調波)と慣性キャビテーションマーカー(ブロードバンド応答)の強度と外観をリアルタイムで測定できるマイクロバブル放出信号のフーリエスペクトルの分析に依存しています。
精密な圧力制御のためのPCD解析は、マイクロバブル製剤の多分散性(振動振幅はバブル径に強く依存する)、ブランド間の気泡殻特性の違い、および音響振動の周波数と圧力30、31、32に強く依存する音響振動のために、正確な圧力制御のためのPCD分析が複雑である。その結果、多くの異なるPCD検出プロトコルが提案されており、これらのすべてのパラメータの特定の組み合わせに適応し、様々なアプリケーションシナリオ(小動物プロトコルを介したインビトロ実験から臨床用PCDまで)で使用され、堅牢なキャビテーション検出、さらには圧力11、14、30、31、32、33、34の遡及フィードバック制御に使用されています。本研究の範囲で用いられるPCDプロトコルはMcDannoldら12に直接由来し、慣性キャビテーション検出のための安定キャビテーションおよび広帯域ノイズの存在のために高調波放出を監視する。
脳のパレンチマへの薬物送達を増加させるBBBの一過性開口のための画像誘導神経ナビゲーションFUSシステムを開発しました。このシステムは、市販のコンポーネントに基づいており、動物施設で利用可能なイメージング技術に応じて、いくつかの異なるイメージングモダリティに容易に適応することができます。高スループットのワークフローが必要なため、画像誘導と治療計画にはX線とBLIを使用することを選択しました。光タンパク質を用いてトランスニューされる腫瘍細胞(例えば、ルシメラーゼ)はBLIイメージング20に適している。光タンパク質基質の投与後、腫瘍細胞は生体内でモニタリングすることができ、腫瘍の成長および位置は20,36と判定することができる。BLIは、低コストのイメージングモダリティであり、経時の腫瘍の成長に従うことを可能にし、高速なスキャン時間を有し、MRI36、37で測定された腫瘍増殖と良好に相関する。私たちは、げっ歯類が取り付けられているプラットフォームを自由に動かすための柔軟性を可能にするために、トランスデューサーに取り付けられた水で満たされたコーンで水浴を置き換えることを選びました8,24.この設計は、X線と光学画像の両立性(III)急速着脱可能な麻酔マスク、および(IV)統合された温度調節された動物加熱システムを備えた(I)小動物立体立体性プラットフォーム(II)受託者マーカーの統合を備えた取り外し可能なプラットフォームに基づいています。麻酔の最初の誘導の後、動物は全体のプロシージャの間に残るプラットホームの精密な位置に取付けられる。その結果、プラットフォーム全体が、正確で再現可能な位置決めと持続麻酔を維持しながら、介入全体のワークフローのすべてのステーションを通過します。この制御ソフトウェアは、受託者マーカーの自動検出を可能にし、すべてのタイプの画像と画像モダリティ(マイクロCT、X線、BLIおよび蛍光イメージング)を、立体的プラットフォームの基準フレームに自動的に登録します。自動較正手順の助けを借りて、超音波トランスデューサの焦点距離は正確に内部に知られており、介入計画、音響送達およびフォローアップ画像分析の自動融合を可能にする。図 1と図 2に示すように、このセットアップは、専用の実験ワークフローを設計する高い柔軟性を提供し、さまざまなステーションでの動物のインターリーブ処理を可能にし、ハイスループット実験を容易にします。我々は、この技術を用い、びまん性正中神経膠腫などの高悪性神経膠腫のマウス異種移植片における薬物送達に成功した。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、脳のパレンチマへの薬物送達増加のための一過性BBB破壊のための費用対効果の高い画像誘導ベースのFUSシステムを開発した。このシステムは、主に市販のコンポーネントとX線およびBLIと組み合わせて構築されました。提案された設計のモジュール性は、高スループットワークフローでの計画と評価のためのいくつかのイメージングモダリティの使用を可能にします。このシステ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトは、KWF-STW(小児びまん性特異性ポンチングリオーマと高級グリオーマにおけるソノポレーションによる薬物送達)によって資金提供されました。イリャ・スカチコフとチャールズ・ムーゲトがシステム開発に参加してくれたことに感謝します。
Materials
| 1 mL luer-lock syringe | Becton Dickinson | 309628 | Plastipak |
| 19 G needle | Terumo Agani | 8AN1938R1 | |
| 23 G needle | Terumo Agani | 8AN2316R1 | |
| 3M Transpore surgical tape | Science applied to life | 7000032707 | or similar |
| Arbitrary waveform generator | Siglent | n.a. | SDG1025, 25 MHz, 125 Msa/s |
| Automated stereotact | in-house built | n.a. | Stereotact with all elements were in-house built |
| Bruker In-Vivo Xtreme | Bruker | n.a. | Includes software |
| Buffered NaCl solution | B. Braun Melsungen AG | 220/12257974/110 | |
| Buprenorfine hydrochloride | Indivior UK limitd | n.a. | 0.324 mg |
| Cage enrichment: paper-pulp smart home | Bio services | n.a. | |
| Carbon filter | Bickford | NC0111395 | Omnicon f/air |
| Ceramic spoon | n.a | n.a. | |
| Cotton swabs | n.a. | n.a. | |
| D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |
| Ethanol | VUmc pharmacy | n.a. | 70% |
| Evans Blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Fresenius NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | n.a. | NaCl 0.9 %, 1000 mL |
| Histoacryl | Braun Surgical | n.a. | Histoacryl 0.5 mL |
| Hydrophone | Precision Acoustics | n.a. | |
| Insulin syringe | Becton Dickinson | 324825/324826 | 0.5 mL and 0.3 mL |
| Isoflurane | TEVA Pharmachemie BV | 8711218013196 | 250 mL |
| Ketamine | Alfasan | n.a. | 10 %, 10 mL |
| Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | Envigo | 2918-11416M | |
| Neoflon catheter | Becton Dickinson | 391349 | 26 GA 0.6 x 19 mm |
| Oscilloscope | Keysight technologies | n.a. | InfiniiVision DSOX024A |
| Plastic tubes | Greiner bio-one | 210261 | 50 mL |
| Power amplifier | Electronics & Innovation Ltd | 210L | Model 210L |
| Preamplifier DC Coupler | Precision Acoustics | n.. | Serial number: DCPS94 |
| Scissors | Sigma Aldrich | S3146-1EA | or similar |
| Sedazine | AST Farma | n.a. | 2% |
| SonoVue microbubbles | Bracco | n.a. | 8 µl/ml |
| Sterile water | Fresenius Kabi | n.a. | 1000 mL |
| Syringe | n.a. | n.a. | various syringes can be used |
| Temgesic | Indivior UK limitd | n.a. | 0.3 mg/ml |
| Transducer | Precision Acoustics | n.a. | 1 MHz |
| Tweezers | Sigma Aldrich | F4142-1EA | or similar |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories Inc. | 01-02 | Aquasonic 100 |
| Vidisic gel | Bausch + Lomb | n.a. | 10 g |
References
- Lipinski, C. A. Lead- and drug-like compounds: the rule-of-five revolution. Drug Discovery Today: Technologies. 1 (4), 337-341 (2004).
- Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discovery Today. 12 (1-2), 54-61 (2007).
- Alli, S., et al. Brainstem blood brain barrier disruption using focused ultrasound: A demonstration of feasibility and enhanced doxorubicin delivery. Journal of Controlled Release. 281, 29-41 (2018).
- Burgess, A., Hynynen, K. Noninvasive and targeted drug delivery to the brain using focused ultrasound. ACS Chemical Neuroscience. 4 (4), 519-526 (2013).
- Meng, Y., et al. Safety and efficacy of focused ultrasound induced blood-brain barrier opening, an integrative review of animal and human studies. Journal of Controlled Release. 309, 25-36 (2019).
- Darrow, D. P. Focused Ultrasound for Neuromodulation. Neurotherapeutics. 16 (1), 88-99 (2019).
- Zhou, Y. F. High intensity focused ultrasound in clinical tumor ablation. World Journal of Clinical Oncology. 2 (1), 8-27 (2011).
- O’Reilly, M. A., Hough, O., Hynynen, K. Blood-Brain Barrier Closure Time After Controlled Ultrasound-Induced Opening Is Independent of Opening Volume. Journal of Ultrasound in Medicine. 36 (3), 475-483 (2017).
- Mainprize, T., et al. Blood-Brain Barrier Opening in Primary Brain Tumors with Non-invasive MR-Guided Focused Ultrasound: A Clinical Safety and Feasibility Study. Scientific Reports. 9 (1), 321 (2019).
- Dasgupta, A., et al. Ultrasound-mediated drug delivery to the brain: principles, progress and prospects. Drug Discovery Today: Technologies. 20, 41-48 (2016).
- O’Reilly, M. A., Waspe, A. C., Chopra, R., Hynynen, K. MRI-guided disruption of the blood-brain barrier using transcranial focused ultrasound in a rat model. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Targeted disruption of the blood-brain barrier with focused ultrasound: association with cavitation activity. Physics in Medicine & Biology. 51 (4), 793 (2006).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Blood-brain barrier disruption induced by focused ultrasound and circulating preformed microbubbles appears to be characterized by the mechanical index. Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (5), 834-840 (2008).
- Sun, T., et al. Closed-loop control of targeted ultrasound drug delivery across the blood-brain/tumor barriers in a rat glioma model. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (48), 10281-10290 (2017).
- Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer’s disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336 (2018).
- Carpentier, A., et al. Clinical trial of blood-brain barrier disruption by pulsed ultrasound. Science Translational Medicine. 8 (343), 342 (2016).
- Chopra, R., Curiel, L., Staruch, R., Morrison, L., Hynynen, K. An MRI-compatible system for focused ultrasound experiments in small animal models. Medical Physics. 36 (5), 1867-1874 (2009).
- Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Targeted delivery of antibodies through the blood–brain barrier by MRI-guided focused ultrasound. Biochemical and Biophysical Research Communications. 340 (4), 1085-1090 (2006).
- Larrat, B., et al. MR-guided transcranial brain HIFU in small animal models. Physics in Medicine & Biology. 55 (2), 365 (2009).
- Contag, C. H., Jenkins, D., Contag, P. R., Negrin, R. S. Use of reporter genes for optical measurements of neoplastic disease in vivo. Neoplasia. 2 (1-2), 41 (2000).
- Choi, J. J., Pernot, M., Small, S. A., Konofagou, E. E. Noninvasive, transcranial and localized opening of the blood-brain barrier using focused ultrasound in mice. Ultrasound in Medicine & Biology. 33 (1), 95-104 (2007).
- Bing, C., et al. Trans-cranial opening of the blood-brain barrier in targeted regions using astereotaxic brain atlas and focused ultrasound energy. Journal of Therapeutic Ultrasound. 2 (1), 13 (2014).
- Marquet, F., et al. Real-time, transcranial monitoring of safe blood-brain barrier opening in non-human primates. PloS One. 9 (2), (2014).
- Anastasiadis, P., et al. characterization and evaluation of a laser-guided focused ultrasound system for preclinical investigations. Biomedical Engineering Online. 18 (1), 36 (2019).
- Liu, H. L., Pan, C. H., Ting, C. Y., Hsiao, M. J. Opening of the blood-brain barrier by low-frequency (28-kHz) ultrasound: a novel pinhole-assisted mechanical scanning device. Ultrasound in Medicine & Biology. 36 (2), 325-335 (2010).
- Zhu, L., et al. Focused ultrasound-enabled brain tumor liquid biopsy. Scientific Reports. 8 (1), 1-9 (2018).
- Bader, K. B., Holland, C. K. Gauging the likelihood of stable cavitation from ultrasound contrast agents. Physics in Medicine & Biology. 58 (1), 127 (2012).
- Neppiras, E. Acoustic cavitation series: part one: Acoustic cavitation: an introduction. Ultrasonics. 22 (1), 25-28 (1984).
- Aryal, M., Arvanitis, C. D., Alexander, P. M., McDannold, N. Ultrasound-mediated blood-brain barrier disruption for targeted drug delivery in the central nervous system. Advanced Drug Delivery Reviews. 72, 94-109 (2014).
- Tung, Y. S., Choi, J. J., Baseri, B., Konofagou, E. E. Identifying the inertial cavitation threshold and skull effects in a vessel phantom using focused ultrasound and microbubbles. Ultrasound in Medicine & Biology. 36 (5), 840-852 (2010).
- Arvanitis, C. D., Livingstone, M. S., Vykhodtseva, N., McDannold, N. Controlled ultrasound-induced blood-brain barrier disruption using passive acoustic emissions monitoring. PloS One. 7 (9), (2012).
- Tsai, C. H., Zhang, J. W., Liao, Y. Y., Liu, H. L. Real-time monitoring of focused ultrasound blood-brain barrier opening via subharmonic acoustic emission detection: implementation of confocal dual-frequency piezoelectric transducers. Physics in Medicine & Biology. 61 (7), 2926 (2016).
- Chen, W. S., Brayman, A. A., Matula, T. J., Crum, L. A. Inertial cavitation dose and hemolysis produced in vitro with or without Optison. Ultrasound in Medicine & Biology. 29 (5), 725-737 (2003).
- Qiu, Y., et al. The correlation between acoustic cavitation and sonoporation involved in ultrasound-mediated DNA transfection with polyethylenimine (PEI) in vitro. Journal of Controlled Release. 145 (1), 40-48 (2010).
- Sun, T., Jia, N., Zhang, D., Xu, D. Ambient pressure dependence of the ultra-harmonic response from contrast microbubbles. The Journal of the Acoustical Society of America. 131 (6), 4358-4364 (2012).
- Rehemtulla, A., et al. Rapid and quantitative assessment of cancer treatment response using in vivo bioluminescence imaging. Neoplasia. 2 (6), 491-495 (2000).
- Puaux, A. L., et al. A comparison of imaging techniques to monitor tumor growth and cancer progression in living animals. International Journal of Molecular Imaging. 2011, (2011).
- Wu, S. K., et al. Characterization of different microbubbles in assisting focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Scientific Reports. 7, 46689 (2017).
- van den Broek, M. P., Groenendaal, F., Egberts, A. C., Rademaker, C. M. Effects of hypothermia on pharmacokinetics and pharmacodynamics. Clinical Pharmacokinetics. 49 (5), 277-294 (2010).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. . Paxinos and Franklin’s the mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2019).
- Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Møllgård, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 385, 385 (2015).
- Yao, L., Xue, X., Yu, P., Ni, Y., Chen, F. Evans blue dye: a revisit of its applications in biomedicine. Contrast Media & Molecular Imaging. 2018, (2018).
- Caretti, V., et al. Monitoring of tumor growth and post-irradiation recurrence in a diffuse intrinsic pontine glioma mouse model. Brain Pathology. 21 (4), 441-451 (2011).
- Yoshimura, J., Onda, K., Tanaka, R., Takahashi, H. Clinicopathological study of diffuse type brainstem gliomas: analysis of 40 autopsy cases. Neurologia Medico-Chirurgica. 43 (8), 375-382 (2003).
- Yang, F. Y., et al. Micro-SPECT/CT-based pharmacokinetic analysis of 99mTc-diethylenetriaminepentaacetic acid in rats with blood-brain barrier disruption induced by focused ultrasound. Journal of Nuclear Medicine. 52 (3), 478-484 (2011).
- Sirsi, S., Borden, M. Microbubble compositions, properties and biomedical applications. Bubble Science, Engineering & Technology. 1 (1-2), 3-17 (2009).
- Greis, C. Technology overview: SonoVue. European Radiology. 14, 11-15 (2004).
- Schneider, M. Characteristics of sonovue. Echocardiography. 16, 743-746 (1999).
- Talu, E., Powell, R. L., Longo, M. L., Dayton, P. A. Needle size and injection rate impact microbubble contrast agent population. Ultrasound in Medicine & Biology. 34 (7), 1182-1185 (2008).
- Pinton, G., et al. Attenuation, scattering, and absorption of ultrasound in the skull bone. Medical Physics. 39 (1), 299-307 (2012).
- Constantinides, C., Mean, R., Janssen, B. J. Effects of isoflurane anesthesia on the cardiovascular function of the C57BL/6 mouse. ILAR journal/National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 52, 21 (2011).
- McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. The effects of oxygen on ultrasound-induced blood-brain barrier disruption in mice. Ultrasound in Medicine & Biology. 43 (2), 469-475 (2017).
- McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. Blood-brain barrier disruption and vascular damage induced by ultrasound bursts combined with microbubbles can be influenced by choice of anesthesia protocol. Ultrasound in Medicine and Biology. 37 (8), 1259-1270 (2011).
