Patologisk analyse af lungemetasase Efter Lateral Hale-Vene Injektion af tumorceller
Summary
Intravenøs injektion af kræftceller bruges ofte i metastaserforskning, men den metastatiske tumorbyrde kan være vanskelig at analysere. Heri demonstrerer vi en hale-vene injektion model af metastaser og omfatter en ny tilgang til at analysere den resulterende metastatiske lungetumor byrde.
Abstract
Metastaser, den primære årsag til sygelighed og dødelighed for de fleste kræftpatienter, kan være udfordrende at modellere præklinisk i mus. Få spontane metastaser modeller er tilgængelige. Således er den eksperimentelle metastasemodel, der involverer haleåreindsprøjtning af egnede cellelinjer, en grundpille i metastaseforskning. Når kræftceller injiceres i den laterale hale-vene, lungen er deres foretrukne sted for kolonisering. En potentiel begrænsning af denne teknik er den nøjagtige kvantificering af den metastatiske lungetumor byrde. Mens nogle efterforskere tæller makrometastaser af en foruddefineret størrelse og / eller omfatter mikromekanikaer efter afsnit af væv, andre bestemme området af metastatiske læsioner i forhold til normale vævsområde. Begge disse kvantificeringsmetoder kan være yderst vanskelige, når den metastatiske byrde er høj. Heri demonstrerer vi en intravenøs injektionsmodel af lungemetastase efterfulgt af en avanceret metode til kvantificering af metastatisk tumorbyrde ved hjælp af billedanalysesoftware. Denne proces giver mulighed for undersøgelse af flere slutpunktsparametre, herunder gennemsnitlig metastasestørrelse, det samlede antal metastaser og det samlede metastaseområde for at give en omfattende analyse. Desuden er denne metode blevet gennemgået af en veterinær patolog bord-certificeret af American College of Veterinary Patologer (SEK) for at sikre nøjagtighed.
Introduction
På trods af at være en meget kompleks og ineffektiv proces1, metastaser er en betydelig bidragyder til sygelighed og dødelighed af kræftpatienter2. Faktisk tilskrives de fleste kræftrelaterede dødsfald metastatisk spredning af sygdom3,4. For at tumorceller med succes kan metastasere, skal de løsne sig fra det primære sted, invadere gennem tilstødende stroma, intravasere i blodcirkulationen eller lymfeknuderne, rejse til kapillærbunden på et sekundært sted, ekstravasere ind i det sekundære væv og formere sig eller vokse til at danne metastatiske læsioner5. Brugen af musemodeller har været afgørende for at fremme forståelsen af de molekylære mekanismer, der er ansvarlige for metastatisk såning og vækst6,7. Heri fokuserer vi på brystkræftmetase, som både genetisk modificerede musemodeller og metoder til transplantation ofte anvendes til – hver med deres eget sæt af fordele og begrænsninger.
Genetisk manipulerede brystsvulstmodeller gør brug af brystkirtlen specifikke initiativtagere, herunder MMTV-LTR (mus mammary tumor virus lang terminal gentage) og WAP (Whey Acidic Protein), at drive udtryk for transgeners i bryst epitel8. Onkogener, herunder polyoma midten T antigen (PyMT), ErbB2/Neu, c-Myc, Wnt-1, og simian virus 40 (SV40) er blevet udtrykt på denne måde9,10,11,12,13, og mens disse genetiske modeller er nyttige til at studere primær tumor indledning og progression, få let metastasere til fjerne organer. Desuden er disse genetiske musemodeller ofte mere tid og omkostninger uoverkommelige end spontane eller eksperimentelle metastasermodeller. I betragtning af begrænsningen af de fleste genetisk manipulerede brystsvulstmodeller til at studere metastaser er transplantationsteknikker blevet attraktive metoder til at studere denne komplekse proces. Dette omfatter ortotopisk, hale-vene, intra hjerte, og intrakraniel injektion af egnede cellelinjer.
Selv om flere brystkræft cellelinjer let metastasere efter ortotopisk injektion i bryst fedt pad14,15, konsistens og reproducerbarhed af metastatisk tumor byrde kan være en udfordring, og varigheden af sådanne undersøgelser kan være på rækkefølgen af flere måneder. Til evaluering af lungemetastase er især intravenøs injektion i halevenen ofte en mere reproducerbar og tidseffektiv metode med metastatisk spredning, der typisk forekommer inden for et par uger. Da den intravenøse injektionsmodel imidlertid omgår de første trin i den metastatiske kaskade, skal der udvises forsigtighed ved fortolkningen af resultaterne af disse undersøgelser. I denne demonstration viser vi haleåreindsprøjtning af brysttumorceller sammen med en nøjagtig og omfattende analysemetode.
Selv om forskersamfundet har gjort betydelige fremskridt med at forstå den komplekse proces med brystkræftmetase, anslås det, at over 150.000 kvinder i øjeblikket har metastatisk brystkræft16. Af dem med fase IV brystkræft, >36% af patienterne har lungemetastase17; Det stedspecifikke mønster og forekomsten af metastaser kan dog variere baseret på molekylær undertype18,19,20,21. Patienter med brystkræft-associerede lungemetastaser har en median overlevelse på kun 21 måneder fremhæver behovet for at identificere effektive behandlinger og nye biomarkører for denne sygdom17. Brugen af eksperimentelle metastaser modeller, herunder intravenøs injektion af tumorceller, vil fortsætte med at fremme vores viden om denne vigtige kliniske udfordring. Når det kombineres med digital billeddannelse patologi og metoden til metastatisk lungetumor byrde analyse beskrevet i denne protokol, hale-vene injektioner er et værdifuldt værktøj til brystkræft metastaser forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som forskere fortsætter med at bruge intravenøs injektion af tumorceller som en eksperimentel model for metastaser, standard praksis for at analysere den resulterende metastatiske tumor byrde mangler. I nogle tilfælde kan signifikante forskelle i metastatisk tumorbyrde ved manipulation af bestemte cellelinjer og / eller brug af kemiske forbindelser observeres makroskopisk. Men i andre tilfælde kan subtile forskelle i metastatisk såning og vækst overses eller fejlfortolkes uden grundig patologisk analyse. Denne unde…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Repræsentative data blev finansieret gennem National Cancer Institute (K22CA218549 til S.T.S). Ud over deres hjælp til at udvikle den omfattende analysemetode rapporteret heri, takker vi The Ohio State University Comprehensive Cancer Center Comparative Pathology and Mouse Phenotyping Shared Resource (Direktør – Krista La Perle, DVM, PhD) for histologi og immunohistochemistry tjenester og Patologi Imaging Core for algoritme udvikling og analyse.
Materials
| alcohol prep pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | for cleaning tail prior to injection |
| dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | for mouse dissection and lung tissue inflation |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | MT10013CV | cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Fisher Scientific | MT21030CV | used for resuspending tumor cells for injection |
| ethanol (70 % solution) | OSU | used to minimize mouse's fur during dissection; use caution – flammable | |
| Evan's blue dye | Millipore Sigma | E2129 | used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution – dangerous reagent |
| Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | F4135 | cell culture media additive; used at 10% in DMEM |
| forceps | Fisher Scientific | 10-270 | for dissection and lung tissue inflation |
| FVB/NJ mice | The Jackson Laboratory | 001800 | syngeneic mouse strain for MVT1 cells |
| hemacytometer (Bright-Line) | Millipore Sigma | Z359629 | for use in cell culture to obtain cell counts |
| insulin syringe (28 G) | Fisher Scientific | 14-829-1B | for tail-vein injections (BD 329424) |
| MDA-MB-231 cells | ATCC | human breast cancer cell line | |
| MVT1 cells | mouse mammary tumor cells | ||
| needles (26 G) | Fisher Scientific | 14-826-15 | used to inflate the mouse's lungs |
| neutral buffered formalin (10%) | Fisher Scientific | 245685 | used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution – dangerous reagent |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource |
| Penicillin Streptomycin 100x | ThermoFisher | 15140163 | cell culture media additive |
| sterile gauze | Fisher Scientific | NC9379092 | for applying pressue to mouse's tail if bleeding occurs |
| syringe (5 mL) | Fisher Scientific | 14-955-458 | used to inflate mouse lung tissue |
| tail-vein restrainer | Braintree Scientific, Inc. | TV-150 STD | used to restrain mouse for tail-vein injections |
| Trypan blue (0.4 %) | ThermoFisher | 15250061 | used in cell culture to assess viability |
| Trypsin-EDTA 0.25 % | ThermoFisher | 25200-114 | used in cell culture to detach tumor cells from plate |
References
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews: Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Steeg, P. S. Targeting metastasis. Nature Reviews: Cancer. 16 (4), 201-218 (2016).
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Steeg, P. S. Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges. Nature Medicine. 12 (8), 895-904 (2006).
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
- Eckhardt, B. L., Francis, P. A., Parker, B. S., Anderson, R. L. Strategies for the discovery and development of therapies for metastatic breast cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (6), 479-497 (2012).
- Gomez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Research. 8 (4), 212 (2006).
- Schoenenberger, C. A., et al. Targeted c-myc gene expression in mammary glands of transgenic mice induces mammary tumours with constitutive milk protein gene transcription. EMBO Journal. 7 (1), 169-175 (1988).
- Nusse, R., Varmus, H. E. Many tumors induced by the mouse mammary tumor virus contain a provirus integrated in the same region of the host genome. Cell. 31 (1), 99-109 (1982).
- Muller, W. J., Sinn, E., Pattengale, P. K., Wallace, R., Leder, P. Single-step induction of mammary adenocarcinoma in transgenic mice bearing the activated c-neu oncogene. Cell. 54 (1), 105-115 (1988).
- Lin, E. Y., et al. Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases. American Journal of Pathology. 163 (5), 2113-2126 (2003).
- Green, J. E., et al. The C3(1)/SV40 T-antigen transgenic mouse model of mammary cancer: ductal epithelial cell targeting with multistage progression to carcinoma. Oncogene. 19 (1), 1020-1027 (2000).
- Iorns, E., et al. A new mouse model for the study of human breast cancer metastasis. PloS One. 7 (10), 47995 (2012).
- Kim, I. S., Baek, S. H. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (3), 443-447 (2010).
- Mariotto, A. B., Etzioni, R., Hurlbert, M., Penberthy, L., Mayer, M. Estimation of the Number of Women Living with Metastatic Breast Cancer in the United States. Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention. 26 (6), 809-815 (2017).
- Xiao, W., et al. Risk factors and survival outcomes in patients with breast cancer and lung metastasis: a population-based study. Cancer Medicine. 7 (3), 922-930 (2018).
- Smid, M., et al. Subtypes of breast cancer show preferential site of relapse. Recherche en cancérologie. 68 (9), 3108-3114 (2008).
- Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. Journal of Clinical Oncology. 28 (20), 3271-3277 (2010).
- Soni, A., et al. Breast cancer subtypes predispose the site of distant metastases. American Journal of Clinical Pathology. 143 (4), 471-478 (2015).
- Leone, B. A., et al. Prognostic impact of metastatic pattern in stage IV breast cancer at initial diagnosis. Breast Cancer Research and Treatment. 161 (3), 537-548 (2017).
- Pei, X. F., et al. Explant-cell culture of primary mammary tumors from MMTV-c-Myc transgenic mice. In Vitro Cellular and Developmental Biology: Animal. 40 (1-2), 14-21 (2004).
- Mathsyaraja, H., et al. CSF1-ETS2-induced microRNA in myeloid cells promote metastatic tumor growth. Oncogene. 34 (28), 3651-3661 (2015).
- Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. Mouse models for tumor metastasis. Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).
- La Perle, K. M. D. Comparative Pathologists: Ultimate Control Freaks Seeking Validation. Veterinary Pathology. 56 (1), 19-23 (2019).
- Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes and Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).
- Borowsky, A. D., et al. Syngeneic mouse mammary carcinoma cell lines: two closely related cell lines with divergent metastatic behavior. Clinical and Experimental Metastasis. 22 (1), 47-59 (2005).
- Yang, Y., et al. Immunocompetent mouse allograft models for development of therapies to target breast cancer metastasis. Oncotarget. 8 (19), 30621-30643 (2017).
- Resch, M., Neels, T., Tichy, A., Palme, R., Rulicke, T. Impact assessment of tail-vein injection in mice using a modified anaesthesia induction chamber versus a common restrainer without anaesthesia. Laboratory Animals. 53 (2), 190-201 (2019).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model. Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
- Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry. Cytometry Part A. 75 (4), 344-355 (2009).
- Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Wright, L. E., et al. Murine models of breast cancer bone metastasis. BoneKEy Reports. 5, 804 (2016).
- Simmons, J. K., et al. Animal Models of Bone Metastasis. Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).
- Liu, Z., et al. Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method. Scientific Reports. 9 (1), 622 (2019).
- Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer. Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).
- Brown, D. L. Practical Stereology Applications for the Pathologist. Veterinary Pathology. 54 (3), 358-368 (2017).
- Aeffner, F., et al. Digital Microscopy, Image Analysis, and Virtual Slide Repository. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 59 (1), 66-79 (2018).
