ניתוח פתולוגי של גרורות ריאות בעקבות הזרקת וריד זנב לרוחב של תאים סרטניים
Summary
הזרקה תוך ורידי של תאים סרטניים משמשת לעתים קרובות במחקר גרורות, אבל נטל הגידול גרורתי יכול להיות קשה לנתח. כאן, אנו מדגימים מודל הזרקת וריד זנב של גרורות וכוללים גישה חדשנית לניתוח נטל גידול הריאות גרורתי שנוצר.
Abstract
גרורות, הגורם העיקרי לתחלואה ותמותה עבור רוב חולי הסרטן, יכול להיות מאתגר למודל פרה-אקליני בעכברים. מעט מודלים ספונטניים של גרורות זמינים. לכן, מודל גרורות ניסיוני מעורבים הזרקת וריד זנב של קווי תאים מתאימים הוא עמוד התווך של מחקר גרורות. כאשר תאים סרטניים מוזרקים לווריד הזנב לרוחב, הריאה היא האתר המועדף עליהם של קולוניזציה. מגבלה פוטנציאלית של טכניקה זו היא כימות מדויק של נטל גידול הריאות גרורתי. בעוד כמה חוקרים לספור macrometastases של גודל מוגדר מראש ו / או לכלול micrometastases בעקבות חתך של רקמות, אחרים קובעים את האזור של נגעים גרורתיים ביחס לאזור הרקמה הרגיל. שתי שיטות הכימות האלה יכולות להיות קשות מאוד כאשר הנטל גרורתי גבוה. להלן, אנו מדגימים מודל הזרקה תוך ורידי של גרורות ריאות ואחריו שיטה מתקדמת לכימות נטל הגידול גרורתי באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. תהליך זה מאפשר לחקור פרמטרים מרובים של נקודת קצה, כולל גודל גרורות ממוצע, מספר גרורות כולל ואזור גרורות כולל, כדי לספק ניתוח מקיף. יתר על כן, שיטה זו נבדקה על ידי לוח פתולוג וטרינרי מוסמך על ידי המכללה האמריקאית לפתולוגים וטרינריים (SEK) כדי להבטיח דיוק.
Introduction
למרות היותו תהליך מורכב מאוד ולא יעיל1, גרורות הוא תורם משמעותי לתחלואה ותמותה של חולי סרטן2. למעשה, רוב מקרי המוות הקשורים לסרטן מיוחסים להתפשטות גרורתית של מחלות3,4. על מנת שתאי הגידול יצאו גרורות בהצלחה, עליהם להתנתק מהאתר הראשי, לפלוש דרך סטרומה סמוכה, לחדור למחזור הדם או ללימפטיקה, לנסוע למיטה נימית של אתר משני, להזרים לרקמה המשנית, ולהתרבות או לגדול כדי ליצור נגעים גרורתיים5. השימוש במודלים של עכברים היה קריטי לקידום ההבנה של המנגנונים המולקולריים האחראים על זריעה גרורתית וצמיחה6,7. כאן, אנו מתמקדים גרורות סרטן השד, אשר הן מודלים עכבר מהונדסים גנטית, כמו גם שיטות השתלה משמשים לעתים קרובות – כל אחד עם סט משלהם של יתרונות ומגבלות.
מודלים של גידולי החלב מהונדסים גנטית עושים שימוש ביזמים ספציפיים לבלוטת החלב, כולל MMTV-LTR (חוזרים על טרמינל ארוך של וירוס החלב של העכבר) ו– WAP (חלבון חומצי מי גבינה), כדי להניע ביטוי של טרנסג’נים באפיתל החלב8. אונקוגנס כולל אנטיגן T בינוני פוליומה (PyMT), ErbB2 / Neu, c-Myc, Wnt-1, ווירוס simian 40 (SV40) באו לידי ביטוי באופן זה9,10,11,12,13, ובעוד מודלים גנטיים אלה שימושיים לחקר חניכת גידול ראשוני והתקדמות, מעטים בקלות גרורות לאיברים רחוקים. יתר על כן, מודלים אלה של עכבר גנטי הם לעתים קרובות יותר זמן ועלות אוסרת מאשר מודלים גרורות ספונטניות או ניסיוניות. בהתחשב בהגבלתם של רוב המודלים של גידולי האם מהונדסים גנטית לחקר גרורות, טכניקות השתלה הפכו לשיטות אטרקטיביות לחקר תהליך מורכב זה. זה כולל אורתוטופיה, וריד זנב, תוך לב, הזרקה תוך גולגולתית של קווי תאים מתאימים.
למרות מספר שורות תא סרטן השד בקלות גרורות בעקבות הזרקה אורתוטופית לתוך כרית שומן חלב14,15, עקביות ושחזור של נטל הגידול גרורתי יכול להיות אתגר, ואת משך המחקרים האלה יכול להיות בסדר של מספר חודשים. להערכת גרורות ריאות, בפרט, הזרקה תוך ורידי לתוך הווריד הזנב היא לעתים קרובות שיטה לשחזור ויעילה יותר עם התפשטות גרורתית המתרחשת בדרך כלל בתוך טווח של כמה שבועות. עם זאת, מאז מודל הזרקה תוך ורידי עוקף את השלבים הראשוניים של מפל גרורתי, יש לנקוט זהירות בפירוש התוצאות של מחקרים אלה. בהדגמה זו, אנו מראים הזרקת וריד זנב של תאי גידול מאמרי יחד עם שיטת ניתוח מדויקת ומקיפה.
למרות שקהילת המחקר התקדמה משמעותית בהבנת התהליך המורכב של גרורות סרטן השד, ההערכה היא כי מעל 150,000 נשים יש כיום סרטן שד גרורתי16. מתוך אלה עם סרטן השד בשלב IV, >36% מהחולים יש גרורות ריאות17; עם זאת, התבנית הספציפית לאתר והשכיחות של גרורות יכולות להשתנות בהתאם לתת-סוג מולקולרי18,19,20,21. חולים עם גרורות ריאות הקשורות לסרטן השד יש הישרדות חציונית של רק 21 חודשים המדגיש את הצורך לזהות טיפולים יעילים סמנים ביולוגיים חדשניים עבור מחלה זו17. השימוש במודלים גרורתיים ניסיוניים, כולל הזרקה תוך ורידי של תאים סרטניים, ימשיך לקדם את הידע שלנו על אתגר קליני חשוב זה. בשילוב עם פתולוגיה הדמיה דיגיטלית ואת השיטה של ניתוח נטל גידול ריאות גרורתי המתואר בפרוטוקול זה, זריקות וריד זנב הם כלי רב ערך לחקר גרורות סרטן השד.
Protocol
Representative Results
Discussion
ככל שהחוקרים ממשיכים להשתמש בהזרקה תוך ורידי של תאים סרטניים כמודל ניסיוני לגרורות, חסרים פרקטיקות סטנדרטיות לניתוח נטל הגידול גרורתי שנוצר. במקרים מסוימים, הבדלים משמעותיים בנטל הגידול גרורתי על מניפולציה של קווי תאים מסוימים ו /או שימוש בתרכובות כימיות ניתן לראות מקרוסקופית. עם זאת, במ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הנתונים הייצוגית מומנו באמצעות המכון הלאומי לסרטן (K22CA218549 ל- S.T.S). בנוסף לסיועם בפיתוח שיטת הניתוח המקיפה המדווחת כאן, אנו מודים למרכז הסרטן המקיף של אוניברסיטת אוהיו ולמשאב המשותף של פנוטיפינג עכבר (מנהל – קריסטה לה פרל, DVM, PhD) על שירותי היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה ולליבת ההדמיה הפתולוגית לפיתוח וניתוח אלגוריתמים.
Materials
| alcohol prep pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | for cleaning tail prior to injection |
| dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | for mouse dissection and lung tissue inflation |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | MT10013CV | cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Fisher Scientific | MT21030CV | used for resuspending tumor cells for injection |
| ethanol (70 % solution) | OSU | used to minimize mouse's fur during dissection; use caution – flammable | |
| Evan's blue dye | Millipore Sigma | E2129 | used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution – dangerous reagent |
| Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | F4135 | cell culture media additive; used at 10% in DMEM |
| forceps | Fisher Scientific | 10-270 | for dissection and lung tissue inflation |
| FVB/NJ mice | The Jackson Laboratory | 001800 | syngeneic mouse strain for MVT1 cells |
| hemacytometer (Bright-Line) | Millipore Sigma | Z359629 | for use in cell culture to obtain cell counts |
| insulin syringe (28 G) | Fisher Scientific | 14-829-1B | for tail-vein injections (BD 329424) |
| MDA-MB-231 cells | ATCC | human breast cancer cell line | |
| MVT1 cells | mouse mammary tumor cells | ||
| needles (26 G) | Fisher Scientific | 14-826-15 | used to inflate the mouse's lungs |
| neutral buffered formalin (10%) | Fisher Scientific | 245685 | used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution – dangerous reagent |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource |
| Penicillin Streptomycin 100x | ThermoFisher | 15140163 | cell culture media additive |
| sterile gauze | Fisher Scientific | NC9379092 | for applying pressue to mouse's tail if bleeding occurs |
| syringe (5 mL) | Fisher Scientific | 14-955-458 | used to inflate mouse lung tissue |
| tail-vein restrainer | Braintree Scientific, Inc. | TV-150 STD | used to restrain mouse for tail-vein injections |
| Trypan blue (0.4 %) | ThermoFisher | 15250061 | used in cell culture to assess viability |
| Trypsin-EDTA 0.25 % | ThermoFisher | 25200-114 | used in cell culture to detach tumor cells from plate |
References
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews: Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Steeg, P. S. Targeting metastasis. Nature Reviews: Cancer. 16 (4), 201-218 (2016).
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Steeg, P. S. Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges. Nature Medicine. 12 (8), 895-904 (2006).
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
- Eckhardt, B. L., Francis, P. A., Parker, B. S., Anderson, R. L. Strategies for the discovery and development of therapies for metastatic breast cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (6), 479-497 (2012).
- Gomez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Research. 8 (4), 212 (2006).
- Schoenenberger, C. A., et al. Targeted c-myc gene expression in mammary glands of transgenic mice induces mammary tumours with constitutive milk protein gene transcription. EMBO Journal. 7 (1), 169-175 (1988).
- Nusse, R., Varmus, H. E. Many tumors induced by the mouse mammary tumor virus contain a provirus integrated in the same region of the host genome. Cell. 31 (1), 99-109 (1982).
- Muller, W. J., Sinn, E., Pattengale, P. K., Wallace, R., Leder, P. Single-step induction of mammary adenocarcinoma in transgenic mice bearing the activated c-neu oncogene. Cell. 54 (1), 105-115 (1988).
- Lin, E. Y., et al. Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases. American Journal of Pathology. 163 (5), 2113-2126 (2003).
- Green, J. E., et al. The C3(1)/SV40 T-antigen transgenic mouse model of mammary cancer: ductal epithelial cell targeting with multistage progression to carcinoma. Oncogene. 19 (1), 1020-1027 (2000).
- Iorns, E., et al. A new mouse model for the study of human breast cancer metastasis. PloS One. 7 (10), 47995 (2012).
- Kim, I. S., Baek, S. H. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (3), 443-447 (2010).
- Mariotto, A. B., Etzioni, R., Hurlbert, M., Penberthy, L., Mayer, M. Estimation of the Number of Women Living with Metastatic Breast Cancer in the United States. Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention. 26 (6), 809-815 (2017).
- Xiao, W., et al. Risk factors and survival outcomes in patients with breast cancer and lung metastasis: a population-based study. Cancer Medicine. 7 (3), 922-930 (2018).
- Smid, M., et al. Subtypes of breast cancer show preferential site of relapse. Recherche en cancérologie. 68 (9), 3108-3114 (2008).
- Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. Journal of Clinical Oncology. 28 (20), 3271-3277 (2010).
- Soni, A., et al. Breast cancer subtypes predispose the site of distant metastases. American Journal of Clinical Pathology. 143 (4), 471-478 (2015).
- Leone, B. A., et al. Prognostic impact of metastatic pattern in stage IV breast cancer at initial diagnosis. Breast Cancer Research and Treatment. 161 (3), 537-548 (2017).
- Pei, X. F., et al. Explant-cell culture of primary mammary tumors from MMTV-c-Myc transgenic mice. In Vitro Cellular and Developmental Biology: Animal. 40 (1-2), 14-21 (2004).
- Mathsyaraja, H., et al. CSF1-ETS2-induced microRNA in myeloid cells promote metastatic tumor growth. Oncogene. 34 (28), 3651-3661 (2015).
- Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. Mouse models for tumor metastasis. Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).
- La Perle, K. M. D. Comparative Pathologists: Ultimate Control Freaks Seeking Validation. Veterinary Pathology. 56 (1), 19-23 (2019).
- Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes and Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).
- Borowsky, A. D., et al. Syngeneic mouse mammary carcinoma cell lines: two closely related cell lines with divergent metastatic behavior. Clinical and Experimental Metastasis. 22 (1), 47-59 (2005).
- Yang, Y., et al. Immunocompetent mouse allograft models for development of therapies to target breast cancer metastasis. Oncotarget. 8 (19), 30621-30643 (2017).
- Resch, M., Neels, T., Tichy, A., Palme, R., Rulicke, T. Impact assessment of tail-vein injection in mice using a modified anaesthesia induction chamber versus a common restrainer without anaesthesia. Laboratory Animals. 53 (2), 190-201 (2019).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model. Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
- Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry. Cytometry Part A. 75 (4), 344-355 (2009).
- Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Wright, L. E., et al. Murine models of breast cancer bone metastasis. BoneKEy Reports. 5, 804 (2016).
- Simmons, J. K., et al. Animal Models of Bone Metastasis. Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).
- Liu, Z., et al. Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method. Scientific Reports. 9 (1), 622 (2019).
- Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer. Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).
- Brown, D. L. Practical Stereology Applications for the Pathologist. Veterinary Pathology. 54 (3), 358-368 (2017).
- Aeffner, F., et al. Digital Microscopy, Image Analysis, and Virtual Slide Repository. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 59 (1), 66-79 (2018).
