Patologisk analyse av lungemetastase etter lateral hale-vene injeksjon av tumorceller

Summary

Intravenøs injeksjon av kreftceller brukes ofte i metastaseforskning, men den metastatiske tumorbyrden kan være vanskelig å analysere. Heri demonstrerer vi en hale-vene injeksjonsmodell av metastase og inkluderer en ny tilnærming for å analysere den resulterende metastatiske lungesvulstbyrden.

Abstract

Metastase, hovedårsaken til sykelighet og dødelighet for de fleste kreftpasienter, kan være utfordrende å modellere preklinisk hos mus. Få spontane metastaseringsmodeller er tilgjengelige. Dermed er den eksperimentelle metastasemodellen som involverer hale-vene injeksjon av egnede cellelinjer en bærebjelke i metastaseforskning. Når kreftceller injiseres i lateral hale-venen, er lungen deres foretrukne koloniseringssted. En potensiell begrensning av denne teknikken er nøyaktig kvantifisering av den metastatiske lungesvulstbyrden. Mens noen etterforskere teller makrometastaser av forhåndsdefinerte størrelser og/eller inkluderer mikrometastaser etter seksjonering av vev, bestemmer andre området metastatiske lesjoner i forhold til normalt vevsområde. Begge disse kvantifiseringsmetodene kan være svært vanskelige når den metastatiske byrden er høy. Heri demonstrerer vi en intravenøs injeksjonsmodell av lungemetastase etterfulgt av en avansert metode for kvantifisering av metastatisk tumorbyrde ved hjelp av bildeanalyseprogramvare. Denne prosessen gjør det mulig å undersøke flere sluttpunktparametere, inkludert gjennomsnittlig metastaseringsstørrelse, totalt antall metastaser og totalt metastaseområde, for å gi en omfattende analyse. Videre har denne metoden blitt gjennomgått av en veterinærpatolog som er sertifisert av American College of Veterinary Pathologists (SEK) for å sikre nøyaktighet.

Introduction

Til tross for å være en svært kompleks og ineffektiv ^prosess1, er metastase en betydelig bidragsyter til sykelighet og dødelighet av ^{kreftpasienter2}. Faktisk tilskrives de fleste kreftrelaterte dødsfall metastatisk spredning av ^sykdom3,4. For at tumorceller skal kunne metastasere, må de løsne fra det primære stedet, invadere gjennom tilstøtende stroma, intravasere i blodsirkulasjon eller lymfatikk, reise til kapillærsengen på et sekundært sted, ekstravasere inn i sekundærvevet og spre seg eller vokse for å danne metastatiske ^lesjoner5. Bruken av musemodeller har vært avgjørende for å fremme forståelsen av de molekylære mekanismene som er ansvarlige for metastatisk såing og ^vekst6,7. Her fokuserer vi på brystkreftmetastase, som både genetisk modifiserte musemodeller samt transplantasjonsmetoder ofte brukes til – hver med sitt eget sett med fordeler og begrensninger.

Genetisk konstruerte brystsvulstmodeller benytter seg av brystkjertelspesifikke promotorer, inkludert MMTV-LTR (musepattedyr tumorvirus lang terminal repetisjon) og WAP (Whey Acidic Protein), for å drive uttrykk for transgenes i pattedyrepitelet8. Oncogenes inkludert polyoma middle T antigen (PyMT), ErbB2/Neu, c-Myc, Wnt-1 og simian virus 40 (SV40) har blitt uttrykt på denne måten9,10,11,12,13, og mens disse genetiske modellene er nyttige for å studere primær tumor initiering og progresjon, få lett metastasere til fjerne organer. Videre er disse genetiske musemodellene ofte mer tids- og kostnadsoverkommelige enn spontane eller eksperimentelle metastasemodeller. Gitt begrensningen av de fleste genetisk konstruerte mammary tumor modeller for å studere metastase, har transplantasjonsteknikker blitt attraktive metoder for å studere denne komplekse prosessen. Dette inkluderer ortotopisk, hale-vene, intrakariac og intrakraniell injeksjon av egnede cellelinjer.

Selv om flere brystkreftcellelinjer lett metastaser etter ortotopisk injeksjon i brystfettputen14,15, kan konsistensen og reproduserbarheten av metastatisk tumorbyrde være en utfordring, og varigheten av slike studier kan være i rekkefølge på flere måneder. For evaluering av lungemetastase er spesielt intravenøs injeksjon i hale-venen ofte en mer reproduserbar og tidseffektiv metode med metastatisk spredning som vanligvis forekommer i løpet av noen uker. Men siden den intravenøse injeksjonsmodellen omgår de første trinnene i den metastatiske kaskaden, må det tas hensyn til å tolke resultatene av disse studiene. I denne demonstrasjonen viser vi hale-vene injeksjon av mammary tumor celler sammen med en nøyaktig og omfattende analysemetode.

Selv om forskersamfunnet har gjort betydelige fremskritt i å forstå den komplekse prosessen med brystkreftmetastase, anslås det at over 150.000 kvinner for tiden har metastatisk ^brystkreft16. Av de med stadium IV brystkreft har >36% av pasientene ^{lungemetastase17}; Det stedsspesifikke mønsteret og forekomsten av metastaser kan imidlertid variere basert på molekylær undertype18,19,20,21. Pasienter med brystkreft-assosierte lungemetastaser har en median overlevelse på bare 21 måneder som fremhever behovet for å identifisere effektive behandlinger og nye biomarkører for denne ^sykdommen17. Bruken av eksperimentelle metastasemodeller, inkludert intravenøs injeksjon av tumorceller, vil fortsette å fremme vår kunnskap om denne viktige kliniske utfordringen. Kombinert med digital avbildningspatologi og metoden for metastatisk lungesvulstbyrdeanalyse beskrevet i denne protokollen, er hale-vene injeksjoner et verdifullt verktøy for brystkreftmetastaseforskning.

Protocol

Dyrebruk fulgte ULAR-regelverket (University Laboratory Animal Resources) i henhold til OSU Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)–godkjent protokoll 2007A0120-R4 (PI: Dr. Gina Sizemore). 1. Hale-vene injeksjon av brystkreftceller Fremstilling av celler og sprøyte til injeksjon Plate et passende antall celler basert på antall mus og cellekonsentrasjon som skal brukes.MERK: Antall celler som injiseres og tid til utvikling av metastaser vil avhenge av celle…

Representative Results

Ved bruk av umerkede celler for hale-vene injeksjon, kan det være vanskelig å bekrefte lungekolonisering før (1) tidspunktet for nekropsi hvis makrometastaser kan observeres eller (2) etter histologisk analyse hvis mikroskopiske metastaser eksisterer. Med omfattende metastatisk lungesvulstbyrde vil mus ha arbeidet med å puste. Som med enhver tumorstudie, bør mus overvåkes nøye gjennom hele studievarigheten. Bruken av merkede celler er en enkel måte å bekrefte vellykket hale-vene injeksjon; derfor bruk av lucifer…

Discussion

Etter hvert som forskere fortsetter å bruke intravenøs injeksjon av tumorceller som en eksperimentell modell for metastase, mangler standard praksis for å analysere den resulterende metastatiske tumorbyrden. I noen tilfeller kan signifikante forskjeller i metastatisk tumorbyrde ved manipulering av bestemte cellelinjer og/eller bruk av kjemiske forbindelser observeres makroskopisk. Men i andre tilfeller kan subtile forskjeller i metastatisk såing og vekst overses eller feiltolkes uten grundig patologisk analyse. Denne…

Materials

alcohol prep pads	Fisher Scientific	22-363-750	for cleaning tail prior to injection
dissection scissors	Fisher Scientific	08-951-5	for mouse dissection and lung tissue inflation
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Fisher Scientific	MT10013CV	cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x	Fisher Scientific	MT21030CV	used for resuspending tumor cells for injection
ethanol (70 % solution)	OSU		used to minimize mouse's fur during dissection; use caution – flammable
Evan's blue dye	Millipore Sigma	E2129	used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution – dangerous reagent
Fetal Bovine Serum	Millipore Sigma	F4135	cell culture media additive; used at 10% in DMEM
forceps	Fisher Scientific	10-270	for dissection and lung tissue inflation
FVB/NJ mice	The Jackson Laboratory	001800	syngeneic mouse strain for MVT1 cells
hemacytometer (Bright-Line)	Millipore Sigma	Z359629	for use in cell culture to obtain cell counts
insulin syringe (28 G)	Fisher Scientific	14-829-1B	for tail-vein injections (BD 329424)
MDA-MB-231 cells	ATCC		human breast cancer cell line
MVT1 cells			mouse mammary tumor cells
needles (26 G)	Fisher Scientific	14-826-15	used to inflate the mouse's lungs
neutral buffered formalin (10%)	Fisher Scientific	245685	used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution – dangerous reagent
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	The Jackson Laboratory	005557	maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource
Penicillin Streptomycin 100x	ThermoFisher	15140163	cell culture media additive
sterile gauze	Fisher Scientific	NC9379092	for applying pressue to mouse's tail if bleeding occurs
syringe (5 mL)	Fisher Scientific	14-955-458	used to inflate mouse lung tissue
tail-vein restrainer	Braintree Scientific, Inc.	TV-150 STD	used to restrain mouse for tail-vein injections
Trypan blue (0.4 %)	ThermoFisher	15250061	used in cell culture to assess viability
Trypsin-EDTA 0.25 %	ThermoFisher	25200-114	used in cell culture to detach tumor cells from plate