Патологический анализ метастазирования в легкие после инъекции опухолевых клеток в латеральную хвостовую вену
Summary
Внутривенное введение раковых клеток часто используется в исследованиях метастазирования, но метастатическую опухолевую нагрузку может быть трудно проанализировать. Здесь мы демонстрируем модель инъекции метастазирования в хвостовую вену и включаем новый подход к анализу результирующей метастатической опухолевой нагрузки на легкие.
Abstract
Метастазы, основная причина заболеваемости и смертности для большинства больных раком, могут быть сложными для доклинического моделирования у мышей. Доступно несколько моделей спонтанного метастазирования. Таким образом, экспериментальная модель метастазирования, включающая инъекцию в хвостовую вену подходящих клеточных линий, является основой исследований метастазирования. Когда раковые клетки вводятся в боковую хвостовую вену, легкие являются их предпочтительным местом колонизации. Потенциальным ограничением этого метода является точная количественная оценка метастатической опухолевой нагрузки на легкие. В то время как некоторые исследователи подсчитывают макрометастазы заранее определенного размера и / или включают микрометастазы после разрезания ткани, другие определяют область метастатических поражений относительно нормальной области ткани. Оба этих метода количественной оценки могут быть чрезвычайно сложными, когда метастатическая нагрузка высока. Здесь мы демонстрируем внутривенную инъекционную модель метастазирования в легких с последующим передовым методом количественной оценки метастатической опухолевой нагрузки с использованием программного обеспечения для анализа изображений. Этот процесс позволяет исследовать несколько параметров конечной точки, включая средний размер метастазирования, общее количество метастазов и общую площадь метастазирования, для обеспечения всестороннего анализа. Кроме того, этот метод был рассмотрен ветеринарным патологоанатомом, сертифицированным Американским колледжем ветеринарных патологов (SEK), для обеспечения точности.
Introduction
Несмотря на то, что метастазирование является очень сложным и неэффективным процессом1, оно вносит значительный вклад в заболеваемость и смертность больных раком2. Фактически, большинство смертей, связанных с раком, объясняются метастатическим распространением болезни3,4. Для того, чтобы опухолевые клетки успешно метастазировали, они должны отделяться от первичного участка, вторгаться через прилегающую строму, интравазать в кровообращение или лимфатическую систему, перемещаться в капиллярное русло вторичного участка, экстравазировать во вторичную ткань и размножаться или расти с образованием метастатических поражений5. Использование мышиных моделей имеет решающее значение для дальнейшего понимания молекулярных механизмов, ответственных за метастатическое посев и рост6,7. Здесь мы фокусируемся на метастазировании рака молочной железы, для которого часто используются как генетически модифицированные мышиные модели, так и методы трансплантации – каждый со своим набором преимуществ и ограничений.
Генетически модифицированные модели опухолей молочной железы используют специфические промоторы молочной железы, включая MMTV-LTR (длинный терминальный повтор вируса опухоли молочной железы мыши) и WAP (сывороточный кислотный белок), для стимулирования экспрессии трансгенов в эпителии молочной железы8. Онкогены, включая полиомный средний Т-антиген (PyMT), ErbB2/Neu, c-Myc, Wnt-1 и обезьяний вирус 40 (SV40), были экспрессированы таким образом9,10,11,12,13, и хотя эти генетические модели полезны для изучения первичного инициации и прогрессирования опухоли, немногие легко метастазируют в отдаленные органы. Кроме того, эти генетические мышиные модели часто являются более временными и дорогостоящими, чем модели спонтанного или экспериментального метастазирования. Учитывая ограниченность большинства генетически модифицированных моделей опухолей молочной железы для изучения метастазирования, методы трансплантации стали привлекательными методами изучения этого сложного процесса. Это включает в себя ортотопическую, заднюю вену, внутрисердечную и внутричерепную инъекцию подходящих клеточных линий.
Хотя несколько клеточных линий рака молочной железы легко метастазируют после ортотопической инъекции в жировую прокладку молочной железы14,15, консистенция и воспроизводимость метастатической опухолевой нагрузки могут быть проблемой, а продолжительность таких исследований может составлять порядка нескольких месяцев. Для оценки метастазирования в легких, в частности, внутривенная инъекция в хвостовую вену часто является более воспроизводимым и эффективным по времени методом с метастатическим распространением, обычно происходящим в течение нескольких недель. Однако, поскольку модель внутривенной инъекции обходит начальные этапы метастатического каскада, необходимо проявлять осторожность при интерпретации результатов этих исследований. В этой демонстрации мы показываем инъекцию опухолевых клеток молочной железы в хвостовую вену вместе с точным и комплексным методом анализа.
Несмотря на то, что исследовательское сообщество добилось значительного прогресса в понимании сложного процесса метастазирования рака молочной железы, по оценкам, более 150 000 женщин в настоящее время имеют метастатический рак молочной железы16. Из пациентов с раком молочной железы IV стадии >36% пациентов имеют метастазы в легкие17; однако сайт-специфическая картина и частота метастазов могут варьироваться в зависимости от молекулярного подтипа18,19,20,21. Пациенты с метастазами в легкие, связанными с раком молочной железы, имеют среднюю выживаемость всего 21 месяц, что подчеркивает необходимость выявления эффективных методов лечения и новых биомаркеров этого заболевания17. Использование экспериментальных моделей метастазирования, включая внутривенную инъекцию опухолевых клеток, будет продолжать расширять наши знания об этой важной клинической проблеме. В сочетании с патологией цифровой визуализации и методом анализа метастатической опухоли легкого, описанным в этом протоколе, инъекции в заднюю вену являются ценным инструментом для исследования метастазирования рака молочной железы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Поскольку исследователи продолжают использовать внутривенную инъекцию опухолевых клеток в качестве экспериментальной модели метастазирования, стандартные методы анализа результирующей метастатической опухолевой нагрузки отсутствуют. В некоторых случаях могут наблюдаться значит…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Репрезентативные данные финансировались через Национальный институт рака (K22CA218549 to S.T.S). В дополнение к их помощи в разработке комплексного метода анализа, о котором сообщается здесь, мы благодарим Комплексный онкологический центр Университета штата Огайо Сравнительная патология и общий ресурс фенотипирования мышей (директор – Криста Ла Перл, DVM, PhD) за услуги гистологии и иммуногистохимии и Pathology Imaging Core за разработку и анализ алгоритмов.
Materials
| alcohol prep pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | for cleaning tail prior to injection |
| dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | for mouse dissection and lung tissue inflation |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | MT10013CV | cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Fisher Scientific | MT21030CV | used for resuspending tumor cells for injection |
| ethanol (70 % solution) | OSU | used to minimize mouse's fur during dissection; use caution – flammable | |
| Evan's blue dye | Millipore Sigma | E2129 | used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution – dangerous reagent |
| Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | F4135 | cell culture media additive; used at 10% in DMEM |
| forceps | Fisher Scientific | 10-270 | for dissection and lung tissue inflation |
| FVB/NJ mice | The Jackson Laboratory | 001800 | syngeneic mouse strain for MVT1 cells |
| hemacytometer (Bright-Line) | Millipore Sigma | Z359629 | for use in cell culture to obtain cell counts |
| insulin syringe (28 G) | Fisher Scientific | 14-829-1B | for tail-vein injections (BD 329424) |
| MDA-MB-231 cells | ATCC | human breast cancer cell line | |
| MVT1 cells | mouse mammary tumor cells | ||
| needles (26 G) | Fisher Scientific | 14-826-15 | used to inflate the mouse's lungs |
| neutral buffered formalin (10%) | Fisher Scientific | 245685 | used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution – dangerous reagent |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource |
| Penicillin Streptomycin 100x | ThermoFisher | 15140163 | cell culture media additive |
| sterile gauze | Fisher Scientific | NC9379092 | for applying pressue to mouse's tail if bleeding occurs |
| syringe (5 mL) | Fisher Scientific | 14-955-458 | used to inflate mouse lung tissue |
| tail-vein restrainer | Braintree Scientific, Inc. | TV-150 STD | used to restrain mouse for tail-vein injections |
| Trypan blue (0.4 %) | ThermoFisher | 15250061 | used in cell culture to assess viability |
| Trypsin-EDTA 0.25 % | ThermoFisher | 25200-114 | used in cell culture to detach tumor cells from plate |
References
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews: Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Steeg, P. S. Targeting metastasis. Nature Reviews: Cancer. 16 (4), 201-218 (2016).
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Steeg, P. S. Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges. Nature Medicine. 12 (8), 895-904 (2006).
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
- Eckhardt, B. L., Francis, P. A., Parker, B. S., Anderson, R. L. Strategies for the discovery and development of therapies for metastatic breast cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (6), 479-497 (2012).
- Gomez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Research. 8 (4), 212 (2006).
- Schoenenberger, C. A., et al. Targeted c-myc gene expression in mammary glands of transgenic mice induces mammary tumours with constitutive milk protein gene transcription. EMBO Journal. 7 (1), 169-175 (1988).
- Nusse, R., Varmus, H. E. Many tumors induced by the mouse mammary tumor virus contain a provirus integrated in the same region of the host genome. Cell. 31 (1), 99-109 (1982).
- Muller, W. J., Sinn, E., Pattengale, P. K., Wallace, R., Leder, P. Single-step induction of mammary adenocarcinoma in transgenic mice bearing the activated c-neu oncogene. Cell. 54 (1), 105-115 (1988).
- Lin, E. Y., et al. Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases. American Journal of Pathology. 163 (5), 2113-2126 (2003).
- Green, J. E., et al. The C3(1)/SV40 T-antigen transgenic mouse model of mammary cancer: ductal epithelial cell targeting with multistage progression to carcinoma. Oncogene. 19 (1), 1020-1027 (2000).
- Iorns, E., et al. A new mouse model for the study of human breast cancer metastasis. PloS One. 7 (10), 47995 (2012).
- Kim, I. S., Baek, S. H. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (3), 443-447 (2010).
- Mariotto, A. B., Etzioni, R., Hurlbert, M., Penberthy, L., Mayer, M. Estimation of the Number of Women Living with Metastatic Breast Cancer in the United States. Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention. 26 (6), 809-815 (2017).
- Xiao, W., et al. Risk factors and survival outcomes in patients with breast cancer and lung metastasis: a population-based study. Cancer Medicine. 7 (3), 922-930 (2018).
- Smid, M., et al. Subtypes of breast cancer show preferential site of relapse. Recherche en cancérologie. 68 (9), 3108-3114 (2008).
- Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. Journal of Clinical Oncology. 28 (20), 3271-3277 (2010).
- Soni, A., et al. Breast cancer subtypes predispose the site of distant metastases. American Journal of Clinical Pathology. 143 (4), 471-478 (2015).
- Leone, B. A., et al. Prognostic impact of metastatic pattern in stage IV breast cancer at initial diagnosis. Breast Cancer Research and Treatment. 161 (3), 537-548 (2017).
- Pei, X. F., et al. Explant-cell culture of primary mammary tumors from MMTV-c-Myc transgenic mice. In Vitro Cellular and Developmental Biology: Animal. 40 (1-2), 14-21 (2004).
- Mathsyaraja, H., et al. CSF1-ETS2-induced microRNA in myeloid cells promote metastatic tumor growth. Oncogene. 34 (28), 3651-3661 (2015).
- Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. Mouse models for tumor metastasis. Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).
- La Perle, K. M. D. Comparative Pathologists: Ultimate Control Freaks Seeking Validation. Veterinary Pathology. 56 (1), 19-23 (2019).
- Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes and Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).
- Borowsky, A. D., et al. Syngeneic mouse mammary carcinoma cell lines: two closely related cell lines with divergent metastatic behavior. Clinical and Experimental Metastasis. 22 (1), 47-59 (2005).
- Yang, Y., et al. Immunocompetent mouse allograft models for development of therapies to target breast cancer metastasis. Oncotarget. 8 (19), 30621-30643 (2017).
- Resch, M., Neels, T., Tichy, A., Palme, R., Rulicke, T. Impact assessment of tail-vein injection in mice using a modified anaesthesia induction chamber versus a common restrainer without anaesthesia. Laboratory Animals. 53 (2), 190-201 (2019).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model. Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
- Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry. Cytometry Part A. 75 (4), 344-355 (2009).
- Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Wright, L. E., et al. Murine models of breast cancer bone metastasis. BoneKEy Reports. 5, 804 (2016).
- Simmons, J. K., et al. Animal Models of Bone Metastasis. Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).
- Liu, Z., et al. Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method. Scientific Reports. 9 (1), 622 (2019).
- Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer. Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).
- Brown, D. L. Practical Stereology Applications for the Pathologist. Veterinary Pathology. 54 (3), 358-368 (2017).
- Aeffner, F., et al. Digital Microscopy, Image Analysis, and Virtual Slide Repository. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 59 (1), 66-79 (2018).
