Modellering av hjernemetastaser gjennom intrakraniell injeksjon og magnetisk resonansavbildning

Summary

Intrakraniell hjernemetastasemodellering er komplisert av manglende evne til å overvåke tumorstørrelse og respons på behandling med presise og belysende metoder. Den presenterte metodikken par intrakraniell tumor injeksjon med magnetisk resonans imaging analyse, som når kombinert, dyrker presise og konsekvente injeksjoner, forbedret dyr overvåking, og nøyaktige tumor volum målinger.

Abstract

Metastatisk spredning av kreft er en uheldig konsekvens av sykdomsprogresjon, aggressive kreftundertyper og/eller sen diagnose. Hjernemetastaser er spesielt ødeleggende, vanskelige å behandle og gir en dårlig prognose. Mens den nøyaktige forekomsten av hjernemetastaser i USA fortsatt er vanskelig å anslå, er det sannsynlig å øke etter hvert som utenomkranielle terapier fortsetter å bli mer effektive i behandling av kreft. Dermed er det nødvendig å identifisere og utvikle nye terapeutiske tilnærminger for å behandle metastase på dette stedet. For dette formål har intrakraniell injeksjon av kreftceller blitt en veletablert metode for å modellere hjernemetastase. Tidligere har manglende evne til å måle tumorvekst direkte vært en teknisk hindring for denne modellen; Men økende tilgjengelighet og kvalitet på små dyr imaging modaliteter, som magnetisk resonans imaging (MR), er i stor grad bedre evnen til å overvåke tumorvekst over tid og utlede endringer i hjernen i løpet av eksperimentell periode. Heri er intrakraniell injeksjon av murine brysttumorceller i immunkompetentmus etterfulgt av MR demonstrert. Den presenterte injeksjontilnærmingen benytter isoflurananestesi og et stereotaktisk oppsett med en digitalt kontrollert, automatisert drill- og nåleinjeksjon for å forbedre presisjonen og redusere tekniske feil. MR måles over tid ved hjelp av et 9,4 Tesla-instrument i Ohio State University James Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource. Tumorvolummålinger demonstreres på hvert tidspunkt gjennom bruk av ImageJ. Samlet sett gir denne intrakranielle injeksjonsmetoden presis injeksjon, daglig overvåking og nøyaktige tumorvolummålinger, som kombinert sterkt forbedrer nytten av dette modellsystemet for å teste nye hypoteser om driverne av hjernemetastaser.

Introduction

Hjernemetastaser er 10 ganger vanligere enn voksne primære sentralnervesystemsvulster¹, og har blitt rapportert i nesten alle faste tumortyper med lungekreft, brystkreft og melanom som viser høyest forekomst². Uavhengig av det primære tumorstedet fører utviklingen av hjernemetastase til en dårlig prognose ofte forbundet med kognitiv nedgang, vedvarende hodepine, anfall, atferdsmessige og / eller personlighetsendringer^1,3,4,5. Når det gjelder brystkreft, har det vært mange fremskritt i forebygging og behandling av sykdommen. Imidlertid vil 30% av kvinnene diagnostisert med brystkreft fortsette å utvikle metastaser, og av de med stadium IV sykdom, ca 7% (SEER 2010-2013) har hjernen metastase^6,7. Nåværende behandlingstilbud for hjernemetastase innebærer kirurgisk reseksjon, stereotaktisk radiokirurgi og/eller hel hjerneradioterapi. Likevel, selv med denne aggressive terapien, er median overlevelse for disse pasientene en kort 8-11 måneder^7,8,9. Disse dystre statistikkene støtter sterkt behovet for identifisering og implementering av nye, effektive terapeutiske strategier. Dermed, som med alle kreftformer som metastaserer til hjernen, er det viktig å modellere brystkreft assosiert hjernemetastase (BCBM) i laboratoriet for å sikre betydelige fremskritt i feltet.

Til dags dato har forskere benyttet en rekke metoder for å studere mekanismer for metastase til hjernen, hver med forskjellige fordeler og^{begrensninger 10,11}. Eksperimentelle metastase metoder som hale vene og intracardiac injeksjon spre tumorceller i hele kroppen og kan resultere i enorme tumor byrde på andre metastatiske steder avhengig av cellene injisert. Disse resultatene er da forvirrende hvis spesifikt studerer metastase til hjernen. Intracarotid arterie injeksjon metoden er en fordel som det spesifikt rettet mot hjerne-seeding av tumorceller, men er begrenset som det kan være teknisk vanskelig å utføre. Ortotopisk primær tumorreseksjon regnes ofte som den mest klinisk relevante metastasemodellen, da den rekastaterer hele metastatisk kaskade. Likevel innebærer denne tilnærmingen lengre ventetider for spontan metastase å skje med dramatisk lavere forekomst av hjernemetastase sammenlignet med de andre metastatiske stedene som lymfeknuten, lungene og leveren. Ofte må dyr fjernes fra studier på grunn av tumorbyrde på disse andre metastatiske stedene før utviklingen av hjernemetastase. Andre metoder som involverer hjernenstropiske cellelinjer er effektive for metastasering til hjernen; Imidlertid er disse modellene begrenset ved at de tar tid å utvikle og ofte mister sin tropisme med forplantning. Gitt disse begrensningene, forskere har rutinemessig brukt intrakraniell injeksjon metode for å modellere kreft metastase til hjernen^11,12,13,14 med varierende metoder^{15,16,17,18,19}. Det er anerkjent at denne tilnærmingen på samme måte har begrensninger, viktigst ved at den ikke tillater undersøkelse av tidlige metastatiske skritt, inkludert intravasasjon ut av den primære svulsten, penetrering gjennom blodhjernebarrieren og etablering i hjernen. Det gjør det imidlertid mulig for forskere å teste (1) hvilke tumoravledede faktorer som medierer vekst i hjernen (f.eks. genetisk manipulering av en onkogen faktor i tumorceller), (2) hvordan endringer i det metastatiske mikromiljøet endrer kreftvekst på dette stedet (f.eks. sammenligning mellom transgene mus med endrede stromale komponenter) og (3) effektivitet av nye terapeutiske strategier på vekst av etablerte lesjoner.

Gitt den potensielle nytten av intrakraniell injeksjonsmodell, er det helt nødvendig å redusere teknisk feil under injeksjon og nøyaktig overvåke tumorvekst over tid. Metoden som er beskrevet her innebærer kontinuerlig nedånding av inhalert gassbedøvelse, og direkte implantasjon av tumorceller i hjernen parenchyma ved hjelp av en stereotaktisk drill og injeksjonsstativ. Administrering av gassbedøvelse gjør det mulig å finjustere dybden og lengden på anestesi, samt sikre en rask og jevn gjenoppretting. Et digitalt kontrollert, automatisert bore- og nåleinjeksjonssystem forbedrer presisjonen på injeksjonsstedet og reduserer tekniske feil som ofte påløper ved boring og frihåndsinjeksjonsmetoder. Bruken av magnetisk resonansavbildning (MR) øker ytterligere presisjonen i overvåking av tumorvekst, tumorvolum, vevsrespons, tumornekrose og respons på behandlingen. MR er bildemodaliteten av valget for bløtvev^20,21. Denne bildeteknikken bruker ikke ironerende stråling og foretrekkes fremfor Computertomography (CT), spesielt for flere bildebehandlingsøkter i løpet av en studie. MR har mye større utvalg av tilgjengelig bløtvev kontrast deretter CT eller ultralyd imaging (USG) og presenterer anatomi i større detalj. Det er mer følsomt og spesifikt for abnormiteter i hjernen selv. MR kan utføres i et hvilket som helst bildeplan uten å fysisk flytte motivet som tilfellet er i 2D USG eller 2D optisk bildebehandling. Det er viktig å nevne at skallen ikke demper MR-signalet som i andre bildemodaliteter. MR tillater evaluering av strukturer som kan skjules av gjenstander fra bein i CT eller USG. En ekstra fordel er at det er mange kontrastmidler tilgjengelig for MR, noe som forbedrer lesjonsdeteksjonsgrensen, med relativt lav toksisitet eller bivirkninger. Viktigere, MR tillater overvåking i sanntid i motsetning til histologisk evaluering på tidspunktet for necropsy, som er begrenset i å tyde tumorvolum. Andre bildemodaliteter, som bioluminescerende bildebehandling, er faktisk effektive for tidlig tumordeteksjon og overvåking over tid; Denne metoden krever imidlertid genetisk manipulering (f.eks. luciferase/GFP-merking) av cellelinjer og tillater ikke volumetriske målinger. MR er ytterligere fordelaktig som det speiler pasientovervåking og nedstrøms volumetrisk analyse av MR-bildene er kjent for å være sterkt korrelert med histologiske tumorstørrelse ved necropsy²². Seriell overvåking med MR-screening øker også klinisk overvåking av nevrologiske funksjonsnedsettering, hvis de oppstår.

Samlet sett gjør den presenterte metoden for stereotaktisk intrakraniell tumorinjeksjon etterfulgt av seriell MR oss i stand til å produsere pålitelige, forutsigbare og målbare resultater for å studere mekanismer for hjernemetastase i kreft.

Protocol

Alle metoder som er beskrevet her, er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Ohio State University (P.I. Gina Sizemore; Protokoll #2007A0120). Alle gnageroverlevelseskirurgi IACUC-retningslinjer følges, inkludert bruk av sterile teknikker, forsyninger, instrumenter, samt pelsfjerning og steril forberedelse av snittstedet. 1. Intrakraniell injeksjon av brystkreftceller MERK: Metoden som er beskrevet her benyttet DB7 murine mammary tumor ce…

Representative Results

Figur 3 oversikter tumorvolum kvantifiseringen for en enkelt mus på to tidspunkter (dag 7 og dag 10) etter injeksjon av murine brysttumorceller. For dette eksperimentet ble 50 000 DB7-celler injisert, og dyrets hjerne ble evaluert av MR. For hver skanning ble 30 skiver (0,5 mm tykkelse) tatt. Evaluering av de 30 skiver per skanning viste at på dag 7 etter injeksjon, 5 skiver utstilt tumor byrde (Figur 3A) og på dag 10 post-injeksjon, 9 skiver utstilt tumor by…

Discussion

Utnyttelsen av intrakraniell injeksjon etterfulgt av seriell overvåking med MR gir den unike evnen til å visualisere tumorvekst med tumorvolumnøyaktighet over tid. Anvendelsen av digital bildeanalyse muliggjør tolkning av hjernelesjoner for tumorvolum, blødning, nekrose og respons på behandlingen.

Som med alle prosedyrer, er det viktige trinn som må følges for å lykkes. For det første er forsiktig oppsett av stereotaktiske enheter avgjørende for suksessen til denne teknikken. På gr…

Materials

Surgical Materials
Betadine	Purdue Products	19-027132	Povidone-iodine, 7.5%
Bone Wax	Surgical Specialities	903	Sterile and malleable beeswax and isopropyl palmitate
Buponorphine SR-Lab	ZooPharm	N/A	Long acting injectable analgesic 5 mL (0.5 mg/mL) polymetric formulation
Cotton tip applicators	Puritan	25-806 10WC	Sterile long stemmed cotton tip applicators
Eye Ointment	Puralube	17033-211-38	Lubricating petrolatum and mineral oil based ophthalmic ointment
Handwarmers	Hothands	HH2	Air-activated heat packs
Ibuprofen	Up & Up	094-01-0245	100mg per 5mL in liquid suspension
Isoflurane	Henry Schein INC	1182097	Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer
Scalpels	Integra Miltex	4-410	#10 disposable scalpel blade
Skin Glue	Vetbond	1469SB	Skin safe wounds adhesive
Sterile Dressing	TIDI Products	25-517	Individually packed sterile drapes
Suture	Covidien	SP5686G	45cm swedged 5-0 monofilament polypropylene suture
Stereotaxic Unit
High Speed Drill (Foredom)	Kopf	Model 1474	Max of 38,000 RPM
Mouse Gas Anesthesia Head Holder	Kopf	Model 923-B	Mouth bar with teeth hole and nosecone
Non-Rupture Ear Bars	Kopf	Model 922	Ear bars suitable for mouse applications
Stereotaxic Instrument	Kopf	Model 940	Base plate, frame and linear scale assembly with digital readout monitor
Injector
Injector Needle and syringe	Hamilton	80366	26 gauge needle, 51 mm needle length and 10 μL volume syringe
Legato 130A automated Syringe Pump	KD Scientific	P/N: 788130	Programmable touch screen base with automated injector
Anesthesia Machine
SomnoSuite Low-Flow Digital Vaporizer	Kent Scientific	SS-01	Digital anesthesia machine
SomnoSuite Starter Kit for mice	Kent Scientific	SOMNO-MSEKIT	Includes induction chamber, 2x anesthesia syringes, 18" tubing, plastic nosecone, 2x waste aneshesia gas canisters