Моделирование метастазов мозга через внутричерепную инъекцию и магнитно-резонансную томографию
Summary
Моделирование метастазов внутричерепного мозга осложняется неспособностью контролировать размер опухоли и реагировать на лечение точными и своевременными методами. Представленная методология пар внутричерепной опухоли инъекций с магнитно-резонансной томографии анализа, который в сочетании, культивирует точные и последовательные инъекции, расширенный мониторинг животных, и точные измерения объема опухоли.
Abstract
Метастатическое распространение рака является печальным следствием прогрессирования заболевания, агрессивных подтипов рака и/или поздней диагностики. Метастазы мозга особенно разрушительны, трудны в лечении и дают плохой прогноз. Хотя точная частота метастазов мозга в Соединенных Штатах по-прежнему трудно оценить, она, вероятно, возрастет, как экстракраниальной терапии продолжают становиться более эффективными в лечении рака. Таким образом, необходимо выявить и разработать новые терапевтические подходы для лечения метастазов на этом участке. С этой целью внутричерепная инъекция раковых клеток стала устоявшимся методом моделирования метастазов в мозг. Ранее неспособность непосредственно измерить рост опухоли была техническим препятствием для этой модели; однако повышение доступности и качества методов визуализации мелких животных, таких как магнитно-резонансная томография (МРТ), значительно улучшает способность контролировать рост опухоли с течением времени и делать выводы об изменениях в головном мозге в течение экспериментального периода. При этом демонстрируется внутричерепная инъекция опухолевых клеток муриновых молочных клеток в иммунокомпетентных мышей с последующим МРТ. Представленный подход к инъекциям использует изофлюрановую анестезию и стереотаксическую установку с цифровым управлением, автоматизированной дрелью и инъекцией иглы для повышения точности и уменьшения технической ошибки. МРТ измеряется с течением времени с помощью 9,4 Тесла инструмент в Университете штата Огайо Джеймс Всеобъемлющий онкологический центр малых животных Imaging Общий ресурс. Измерения объема опухоли демонстрируются в каждой точке времени с помощью ImageJ. В целом, этот подход к внутричерепным инъекциям позволяет проводить точные инъекции, изо дня в день мониторинг и точные измерения объема опухоли, которые в совокупности значительно повышают полезность этой модельной системы для проверки новых гипотез о драйверах метастазов в мозг.
Introduction
Метастазы мозга в 10 раз чаще, чем взрослые первичные опухолицентральной нервной системы 1, и были зарегистрированы почти в каждом твердом типе опухоли с раком легких, раком молочной железы и меланомой, проявляют самуювысокую заболеваемость 2. Независимо от первичного участка опухоли, развитие метастазов мозга приводит к плохому прогнозу, часто связанному с когнитивным снижением, постоянными головными болями, судорогами, поведенческимии/или изменениями личности 1,,3,,4,,5. Что касается рака молочной железы, то было много достижений в области профилактики и лечения этого заболевания. Тем не менее, 30% женщин с диагнозом рака молочной железы будет продолжать развиваться метастазы, и тех, с болезнью IV стадии, примерно 7% (SEER 2010-2013) имеют метастазымозга 6,7. Текущие варианты лечения метастазов мозга включают хирургическую ресекцию, стереотаксическую радиохирургию и/или лучевую терапию всего мозга. Тем не менее, даже с этой агрессивной терапии, средняя выживаемость для этих пациентов короткий 8-11месяцев 7,8,9. Эти мрачные статистические данные решительно поддерживают необходимость выявления и осуществления новых эффективных терапевтических стратегий. Таким образом, как и все виды рака, которые метастазируют в мозг, важно правильно моделировать рак молочной железы связанных метастазов мозга (BCBM) в лаборатории, чтобы обеспечить значительные достижения в этой области.
На сегодняшний день исследователи использовали различные методологии для изучения механизмов метастазирования в мозг, каждый с различными преимуществами иограничениями 10,11. Экспериментальные методы метастазирования, такие как хвостовая вена и внутрикардовая инъекция, распространяют опухолевые клетки по всему телу и могут привести к огромному бремени опухоли в других метастатических участках в зависимости от вводимых клеток. Эти результаты затем путают, если конкретно изучение метастазов в мозг. Метод инъекций внутрикаротидной артерии является выгодным, поскольку он конкретно нацелен на мозг посева опухолевых клеток, но ограничен, как это может быть технически трудно выполнить. Ортопедическая первичная ресекция опухоли часто считается наиболее клинически релевантной моделью метастазов, поскольку она резюмирует весь метастатический каскад. Тем не менее, этот подход включает в себя длительные периоды ожидания спонтанных метастазов происходит с резко более низкими темпами метастазирования мозга по сравнению с другими метастатическими сайтами, такими как лимфатический узел, легкие и печень. Часто, животные должны быть удалены из исследований из-за бремени опухоли в этих других метастатических местах до развития метастазов мозга. Другие методы, связанные с линиями клеток мозга, эффективны при метастазах в мозг; однако, эти модели ограничены в том, что они принимают время, чтобы развиваться и часто теряют свой тропизм с распространением. Учитывая эти ограничения, исследователи регулярно использовали внутричерепный метод инъекции для моделирования метастазов рака в мозг11,,12,,13,,14 с различными методологиями15,16,17,18,19. Признается, что этот подход также имеет ограничения, самое главное в том, что он не позволяет для исследования ранних метастатических шагов, включая интравазию из первичной опухоли, проникновение через геммозефалический барьер, и создание в головном мозге. Тем не менее, это позволяет исследователям проверить (1) какие опухолевые факторы являются посредником роста в головном мозге (например, генетические манипуляции онкогенного фактора в опухолевых клетках), (2) как изменения в метастатической микросреду изменить рост рака на этом сайте (например, сравнение между трансгенными мышами с измененными стромальными компонентами) и (3) эффективность новых терапевтических стратегий по росту установленных поражений.
Учитывая потенциальную полезность внутричерепной модели инъекций, абсолютно необходимо уменьшить техническую ошибку во время инъекций и точно контролировать рост опухоли с течением времени. Описанный в настоящем случае метод включает в себя непрерывную дозасывую анестезию газа и прямую имплантацию опухолевых клеток в паренхиму мозга с помощью стереотаксического сверла и инъекционного стенда. Администрирование газовой анестезии позволяет тонко настроить глубину и длину анестезии, а также обеспечить быстрое и плавное восстановление. Цифровая автоматизированная система сверла и впрыска игл повышает точность инъекций и уменьшает техническую ошибку, часто понесенную методами бурения и свободного впрыска. Использование магнитно-резонансной томографии (МРТ) еще больше повышает точность мониторинга роста опухоли, объема опухоли, реакции тканей, некроза опухоли и реакции на лечение. МРТ является визуализация модальности выбора для мягкихтканей 20,21. Этот метод визуализации не использует ионизирующее излучение и предпочтительнее компьютерной томографии (КТ), особенно для нескольких сеансов визуализации в ходе исследования. МРТ имеет гораздо больший спектр доступных мягких тканей контраста, то КТ или ультразвуковой визуализации (USG) и представляет анатомию более подробно. Он более чувствителен и специфичен для аномалий в самом мозге. МРТ может быть выполнена в любой плоскости изображения без физического перемещения предмета, как это имеет место в 2D USG или 2D оптической визуализации. Важно отметить, что череп не затухает сигнал МРТ, как и в других условиях визуализации. МРТ позволяет проводить оценку структур, которые могут быть скрыты артефактами из костей в КТ или USG. Дополнительным преимуществом является то, что Есть много контрастных агентов, доступных для МРТ, что повышает предел обнаружения поражения, с относительно низкой токсичностью или побочными эффектами. Важно отметить, что МРТ позволяет осуществлять мониторинг в режиме реального времени в отличие от гистологической оценки во время некропсии, которая ограничена в расшифровке объема опухоли. Другие методы визуализации, такие как биолюминесцентные изображения, действительно эффективны для раннего выявления опухолей и мониторинга с течением времени; однако, этот метод требует генетических манипуляций (например, люцифераза/ GFP пометки) клеточных линий и не позволяет объемных измерений. МРТ является еще более выгодным, поскольку он отражает мониторинг пациента и вниз по течению объемный анализ изображений MR, как известно, сильно коррелирует с гистологическим размером опухоли принекропсии 22. Серийный мониторинг с МРТ-скринингом также увеличивает клинический мониторинг неврологических нарушений, если они возникают.
В целом, представленный метод стереотаксической внутричерепной инъекции опухоли с последующим серийным МРТ позволяет нам производить надежные, предсказуемые и измеримые результаты для изучения механизмов метастазирования мозга при раке.
Protocol
Representative Results
Discussion
Использование внутричерепной инъекции с последующим серийным мониторингом с МРТ обеспечивает уникальную способность визуализировать рост опухоли с точностью объема опухоли с течением времени. Применение цифрового анализа изображений позволяет работать с интерпретацией поражений …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Представительные данные финансировались через Национальный институт рака (K22CA218472 до G.M.S.). Внутричерепные инъекции выполняются в Университете штата Огайо Всеобъемлющего онкологического центра Целевой Валидации Общий ресурс (директор – д-р Рина Shakya) и МРТ завершается в Университете штата Огайо Всеобъемлющий онкологический центр Малых животных Imaging Общий ресурс (директор – д-р Кимерди Пауэлл). Оба общих ресурсов финансируются через OSUCCC, OSUCCC онкологический центр Поддержка Грант от Национального института рака (P30 CA016058), партнерские отношения с колледжами и департаментами Университета штата Огайо, а также созданы системы возврата заряда.
Materials
| Surgical Materials | |||
| Betadine | Purdue Products | 19-027132 | Povidone-iodine, 7.5% |
| Bone Wax | Surgical Specialities | 903 | Sterile and malleable beeswax and isopropyl palmitate |
| Buponorphine SR-Lab | ZooPharm | N/A | Long acting injectable analgesic 5 mL (0.5 mg/mL) polymetric formulation |
| Cotton tip applicators | Puritan | 25-806 10WC | Sterile long stemmed cotton tip applicators |
| Eye Ointment | Puralube | 17033-211-38 | Lubricating petrolatum and mineral oil based ophthalmic ointment |
| Handwarmers | Hothands | HH2 | Air-activated heat packs |
| Ibuprofen | Up & Up | 094-01-0245 | 100mg per 5mL in liquid suspension |
| Isoflurane | Henry Schein INC | 1182097 | Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer |
| Scalpels | Integra Miltex | 4-410 | #10 disposable scalpel blade |
| Skin Glue | Vetbond | 1469SB | Skin safe wounds adhesive |
| Sterile Dressing | TIDI Products | 25-517 | Individually packed sterile drapes |
| Suture | Covidien | SP5686G | 45cm swedged 5-0 monofilament polypropylene suture |
| Stereotaxic Unit | |||
| High Speed Drill (Foredom) | Kopf | Model 1474 | Max of 38,000 RPM |
| Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 923-B | Mouth bar with teeth hole and nosecone |
| Non-Rupture Ear Bars | Kopf | Model 922 | Ear bars suitable for mouse applications |
| Stereotaxic Instrument | Kopf | Model 940 | Base plate, frame and linear scale assembly with digital readout monitor |
| Injector | |||
| Injector Needle and syringe | Hamilton | 80366 | 26 gauge needle, 51 mm needle length and 10 μL volume syringe |
| Legato 130A automated Syringe Pump | KD Scientific | P/N: 788130 | Programmable touch screen base with automated injector |
| Anesthesia Machine | |||
| SomnoSuite Low-Flow Digital Vaporizer | Kent Scientific | SS-01 | Digital anesthesia machine |
| SomnoSuite Starter Kit for mice | Kent Scientific | SOMNO-MSEKIT | Includes induction chamber, 2x anesthesia syringes, 18" tubing, plastic nosecone, 2x waste aneshesia gas canisters |
References
- Lin, X., DeAngelis, L. M. Treatment of Brain Metastases. Journal of Clinical Oncology. 33 (30), 3475-3484 (2015).
- Ostrom, Q. T., Wright, C. H., Barnholtz-Sloan, J. S. Brain metastases: epidemiology. Handbook of Clinical Neurology. 149, 27-42 (2018).
- Eichler, A. F., et al. The biology of brain metastases-translation to new therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 8 (6), 344-356 (2011).
- Steeg, P. S., Camphausen, K. A., Smith, Q. R. Brain metastases as preventive and therapeutic targets. Nature Reviews Cancer. 11 (5), 352-363 (2011).
- Valiente, M., et al. The Evolving Landscape of Brain Metastasis. Trends in Cancer. 4 (3), 176-196 (2018).
- Wang, H., et al. The prognosis analysis of different metastasis pattern in patients with different breast cancer subtypes: a SEER based study. Oncotarget. 8 (16), 26368-26379 (2017).
- Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
- Gong, Y., Liu, Y. R., Ji, P., Hu, X., Shao, Z. M. Impact of molecular subtypes on metastatic breast cancer patients: a SEER population-based study. Scientific Reports. 7, 45411 (2017).
- Kim, Y. J., Kim, J. S., Kim, I. A. Molecular subtype predicts incidence and prognosis of brain metastasis from breast cancer in SEER database. Journal of Cancer Researchearch and Clinical Oncology. 144 (9), 1803-1816 (2018).
- Gomez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
- Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer. Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).
- Meisen, W. H., et al. Changes in BAI1 and nestin expression are prognostic indicators for survival and metastases in breast cancer and provide opportunities for dual targeted therapies. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (1), 307-314 (2015).
- Russell, L., et al. PTEN expression by an oncolytic herpesvirus directs T-cell mediated tumor clearance. Nature Communications. 9 (1), 5006 (2018).
- Thies, K. A., et al. Stromal platelet-derived growth factor receptor-beta signaling promotes breast cancer metastasis in the brain. Recherche en cancérologie. , (2020).
- Kramp, T. R., Camphausen, K. Combination radiotherapy in an orthotopic mouse brain tumor model. Journal of Visualized Experiments. (61), e3397 (2012).
- Pierce, A. M., Keating, A. K. Creating anatomically accurate and reproducible intracranial xenografts of human brain tumors. Journal of Visualized Experiments. (91), e52017 (2014).
- Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. Journal of Visualized Experiments. (57), e3403 (2011).
- Donoghue, J. F., Bogler, O., Johns, T. G. A simple guide screw method for intracranial xenograft studies in mice. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Fink, J. R., Muzi, M., Peck, M., Krohn, K. A. Multimodality Brain Tumor Imaging: MR Imaging, PET, and PET/MR Imaging. Journal of Nuclear Medicine. 56 (10), 1554-1561 (2015).
- Borges, A. R., Lopez-Larrubia, P., Marques, J. B., Cerdan, S. G. MR imaging features of high-grade gliomas in murine models: how they compare with human disease, reflect tumor biology, and play a role in preclinical trials. American Journal of Neuroradiology. 33 (1), 24-36 (2012).
- Prabhu, S. S., Broaddus, W. C., Oveissi, C., Berr, S. S., Gillies, G. T. Determination of intracranial tumor volumes in a rodent brain using magnetic resonance imaging, Evans blue, and histology: a comparative study. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 47 (2), 259-265 (2000).
- Borowsky, A. D., et al. Syngeneic mouse mammary carcinoma cell lines: two closely related cell lines with divergent metastatic behavior. Clinical & Experimental Metastasis. 22 (1), 47-59 (2005).
- Journal of Visualized Experiments. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration I. Journal of Visualized Experiments. , (2020).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Lee, D., Marcinek, D. Noninvasive in vivo small animal MRI and MRS: basic experimental procedures. Journal of Visualized Experiments. (32), (2009).
- Shah, N., et al. Investigational chemotherapy and novel pharmacokinetic mechanisms for the treatment of breast cancer brain metastases. Pharmacological Research. 132, 47-68 (2018).
