הדמיה וניתוח של שמן אדום O מוכתם כולו אבי העורקים נגעים במודל עכבר היפרליפידמיה מפרצת
Summary
פרוטוקול זה מספק הליך שלב אחר שלב לניתוח נטל טרשת עורקים בעכברים. חוקרים יכולים להשתמש בפרוטוקול זה כדי להשוות את השפע, המיקום והגודל של נגעים טרשת עורקים בבעלי חיים שונים.
Abstract
Apolipoprotein E (Apoe)- או קולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (Ldlr)-עכברים היפרליפידמיים לקויים הם שני המודלים הנפוצים ביותר למחקר טרשת עורקים. הם משמשים כדי לחקור את ההשפעה של גורמים גנטיים שונים וסוגי תאים שונים על היווצרות נגע טרשת עורקים, כמו גם לבדוק את הפיתוח של טיפולים חדשים. בידוד, כריתה של אבי העורקים כולו, וכימות של שמן אדום O מוכתם נגעים טרשת עורקים הם שיטות מורפומטריות בסיסיות המשמשות להערכת נטל טרשת עורקים. מטרת פרוטוקול זה היא לתאר שיטה כירורגית ממוטבת, צעד אחר צעד כדי לנתח, perfuse-fix, לבודד, כתם, תמונה ולנתח נגעים טרשת עורקים באב העורקים של העכבר עם שמן אדום O. מכיוון שנגעים טרשת עורקים יכולים להיווצר בכל מקום בכל עץ אבי העורקים, כל שיטת הכתמת שמן אבי העורקים האדומה O יש את היתרון של הערכת לוחות עמוסי שומנים בדם באבי העורקים כולו וכל הענפים בעכבר אחד. בנוסף להכתמת שמן אדום O, אבי העורקים המלאים המבודדים הטריים יכולים לשמש למגוון של הפריה חוץ גופית וניסויים in vivo ובידודי תאים.
Introduction
מחלת לב כלילית, גורם מוביל לתמותה בארה”ב, נגרמת בדרך כלל על ידי טרשת עורקים, תהליך שמוביל להצטברות של פלאק בתוך קירות עורקים1. עכברים אפו- ו– Ldlr-נוטים להיפרליפידמיה הם מרכזיים בחקירות של טרשת עורקים וסיבוכיה ופיתוח הטיפולים2,3,4,5. כימות של נגעים טרשת עורקים מאבי העורקים en face הוא ניתוח נקודת קצה חשוב להערכת ההשפעה של מניפולציה גנטית בסוגי תאים שונים. זה גם עוזר ללמוד טיפולים חדשניים שנועדו להשפיע על ייזום מחלות טרשת עורקים, התקדמות ורגרסיה. נגעים טרשת עורקים יכולים להיווצר בכל מקום באבי העורקים ובענפיו (כלומר, עורקים ברכיוצפליים, עורקי הראש ותת-סלברי בחזה, כמו גם עורקי כליות, איליאק משותף ועצם הירך מתחת לסרעפת)6. הערכה מקיפה של נטל טרשת עורקים וטיפול מתאים דורשת הערכה של נטל המחלה במקומות שונים, אתגר שלעתים קרובות מתעלמים ממנו.
פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע ניתוח מקיף של נגעים טרשת עורקים, החל אבי העורקים שלם שלא נפתח וממשיך להכנה פנים, בעכבר אחד. כתמי שמן O אדום של שמן אבי העורקים שלא נפתחו מאפשר הערכה מהירה ואיכותית של לוחות עמוסי שומנים בדם בכל אבי העורקים וענפיו, בעוד הכנה לפנים מספקת הערכה כמותית של התפלגות נגע טרשת עורקים באבי העורקים של העכבר.
הטכניקה משתמשת בעכברים בני 8 שבועות עם מחיקת TGFβR2 ספציפית לתא שריר חלק על הרקע האפו-/היפרליפידמי (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/-; להלן מכונה עכברי TGFβR2iSMC-Apoe) ובקרות Apoe-/- המלטה (MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe-/-; להלן מכונה Apoe-/- עכברים). בעלי החיים נשמרים במשך 16 שבועות על דיאטה עתירת כולסטרול גבוהה שומן (HCHFD) כחומרי מחקר7. בסיום המחקר, אבי העורקים המלאים שלא נפתחו מוכתמים ומדומים (כולל כל הענפים העיקריים) עם שמן אדום O להערכה איכותית של לוחות עמוסי שומנים בדם. אבי העורקים נחתכים פתוחים באמצעות הכנה לפנים, וכל הנגעים הטרשת עורקים הם בתמונה ומכמתים. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ללמוד התפתחות נגע טרשת עורקים ב Apoe-/- או Ldlr-/- מודלים עכברים היפרליפידמיה ומורחב ליישומים כלליים הקשורים אבי העורקים ביולוגיה וסקולרית.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apolipoprotein E (Apoe) ו צפיפות נמוכה ליפופרוטאין קולטן (Ldlr) עכברים לקויים שימושיים לחקר פיתוח וטיפול של טרשת עורקים. חוקרים יכולים להעריך את ההשפעה של גנטיקה ומניפולציות טיפוליות על ייזום מחלות הקשורות לטרשת עורקים, התקדמות ורגרסיה באמצעות מכתם שמן אדום O של אבי העורקים כולו</sup…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה, בין השאר, על ידי קונסורציום ביולוגיה משותף Microgrant שסופק תחת מענק NIH P30AR070253 (P.-Y.C.), ו HL135582 (MS. ). אנו מודים לר’ וובר ול.ל. קון על תחזוקת העכברים המשמשים במחקר זה.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | DENVILLE | C2170 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 16% Formaldehyde | Polysciences | 18814-10 | |
| 70% ethanol | VWR | RC2546.70-5 | To clean the dissection tools |
| Black dissection wax | CR Scientific | C3541 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | Solvent for Tamoxifen |
| DNeasy Blood & Tissue kit | QIAGEN | 69506 | To isolate DNA from mouse ear |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (1X DPBS), pH 7.4 | Gibco | 14190-144 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | |
| High cholesterol high fat diet | Research Diets | D12108 | To induce atherosclerosis |
| Imaging software | National Institutes of Health | Image J | Aortic lesion quantification |
| Isopropanol | VWR | JT9079-5 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | To clean the glass microscope slides |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | ROBOZ | RS-5602 | To separate the heart and the aorta and to cut open the aorta and aorta branches |
| Microscope control software | Olympus | DP Controller | For aorta imaging |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Needle-25G | BD | 305124 | |
| NonWoven Sponge | McKesson | 94442000 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | To stain the atherosclerosis lesions |
| Pall Acrodisc Sterile Syringe Filters with Super Membrane | VWR | 28143-312 | To filter working Oil Red O solution |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15021-15 | To dissect and clean the aorta |
| Statistical software | GraphPad | Prism 8 | Statical analysis |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | For aorta dissection |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | For aorta imaging |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | To induce Cre-loxP recombination |
| Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek | VWR | 25608-930 | |
| Tweezer Style 4 | Electron Microscopy Sciences | 0302-4-PO | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Tweezer Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 0302-5-PO | To dissect and clean the aorta |
References
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
- Emini Veseli, B., et al. Animal models of atherosclerosis. European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).
- Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71, 343-353 (1992).
- Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 258, 468-471 (1992).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. Journal of Clinical Investigation. 92, 883-893 (1993).
- Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arteriosclerosis Thrombosis. 14, 133-140 (1994).
- Chen, P. Y., et al. Smooth muscle cell reprogramming in aortic aneurysms. Cell Stem Cell. 26, 542-557 (2020).
- Andres-Manzano, M. J., Andres, V., Dorado, B. Oil Red O and Hematoxylin and Eosin Staining for Quantification of Atherosclerosis Burden in Mouse Aorta and Aortic Root. Methods in Molecular Biology. 1339, 85-99 (2015).
- Chen, P. Y., et al. Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis. Nature Metabolism. 1, 912-926 (2019).
- Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nature Protocols. 8, 1149-1154 (2013).
- Ferruzzi, J., Madziva, D., Caulk, A. W., Tellides, G., Humphrey, J. D. Compromised mechanical homeostasis in arterial aging and associated cardiovascular consequences. Biomechanics and Modeling Mechanobiology. 17, 1281-1295 (2018).
