Imaging e analisi delle lesioni dell'aorta intera O-macchiata di olio rosso in un modello murino di iperlipidemia da aneurisma
Summary
Questo protocollo fornisce una procedura passo-passo per analizzare il carico aterosclerotico nei topi. I ricercatori possono utilizzare questo protocollo per confrontare l’abbondanza, la posizione e le dimensioni delle lesioni aterosclerotiche in diversi animali.
Abstract
I topi iperlipidemici carenti di apolipoproteina E (Apoe) o recettore delle lipoproteine a bassa densità (Ldlr) sono i due modelli più comunemente usati per la ricerca sull’aterosclerosi. Sono utilizzati per studiare l’impatto di vari fattori genetici e diversi tipi di cellule sulla formazione di lesioni aterosclerotiche e per testare lo sviluppo di nuove terapie. L’isolamento, l’escissione dell’intera aorta e la quantificazione delle lesioni aterosclerotiche colorate di Oil Red O sono metodi morfometrici di base utilizzati per valutare il carico aterosclerotico. L’obiettivo di questo protocollo è descrivere un metodo chirurgico ottimizzato e passo-passo per sezionare, perfuse-fix, isolare, macchiare, immaginare e analizzare le lesioni aterosclerotiche nelle aorte di topo con Oil Red O. Poiché le lesioni aterosclerotiche possono formarsi ovunque nell’intero albero aortico, questo intero metodo di colorazione Red O dell’olio di aorta ha il vantaggio di valutare le placche cariche di lipidi nell’intera aorta e in tutti i rami in un singolo topo. Oltre alla colorazione Oil Red O, le aorte intere isolate fresche possono essere utilizzate per una varietà di esperimenti in vitro e in vivo e isolamenti cellulari.
Introduction
La malattia coronarica, una delle principali cause di mortalità negli Stati Uniti, è solitamente causata dall’aterosclerosi, un processo che porta all’accumulo di placca all’interno delle pareti arteriose1. I topi con deficit di Apoe e Ldlr soggetti a iperlipidemia sono fondamentali per le indagini sull’aterosclerosi e le sue complicanze e lo sviluppo di terapie2,3,4,5. La quantificazione delle lesioni aterosclerotiche da un’aorta en face è un’importante analisi finale per valutare l’impatto della manipolazione genetica in diversi tipi di cellule. Aiuta anche a studiare nuove terapie progettate per influenzare l’inizio, la progressione e la regressione della malattia aterosclerotica. Le lesioni aterosclerotiche possono formarsi ovunque nell’aorta e nei suoi rami (cioè arterie brachiocefale, carotidi e succlavia nel torace, nonché arterie renali, iliache e femorali comuni sotto il diaframma)6. Una valutazione completa del carico di aterosclerosi e una terapia appropriata richiedono una valutazione del carico di malattia in diverse località, una sfida che viene spesso trascurata.
Questo protocollo descrive come eseguire un’analisi completa delle lesioni aterosclerotiche, iniziando con un’aorta intera non aperta e procedendo alla preparazione del viso, in un singolo topo. La colorazione Red O dell’olio di aorta intera non aperta consente una valutazione rapida e qualitativa delle placche cariche di lipidi nell’intera aorta e nei suoi rami, mentre la preparazione del viso fornisce una valutazione quantitativa della distribuzione della lesione aterosclerotica nell’aorta del topo.
La tecnica utilizza topi di 8 settimane con una delezione TGFβR2 specifica per le cellule muscolari lisce sullo sfondo iperlipidemico Apoe-/- (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/-; di seguito denominati topi TGFβR2iSMC-Apoe) e controlli Apoe-/- littermate (MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe-/-; di seguito denominati Apoe-/- topi). Gli animali sono tenuti per 16 settimane con una dieta ricca di colesterolo alto contenuto di grassi (HCHFD) come materiali di studio7. Al termine dello studio, le aorte intere non aperte vengono macchiate e fotografate (compresi tutti i rami principali) con Oil Red O per la valutazione qualitativa delle placche cariche di lipidi. Le aorte vengono aperte attraverso la preparazione del viso e tutte le lesioni aterosclerotiche vengono visualizzate e quantificate. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare lo sviluppo della lesione aterosclerotica in modelli di topi iperlipidemia Apoe-/– o Ldlr-/- ed esteso ad applicazioni di biologia vascolare generale correlate all’aorta.
Protocol
Representative Results
Discussion
I topi carenti di apolipoproteina E (Apoe) e recettore delle lipoproteine a bassa densità (Ldlr) sono utili per studiare lo sviluppo e il trattamento dell’aterosclerosi. I ricercatori possono valutare l’impatto della genetica e delle manipolazioni terapeutiche sull’inizio, la progressione e la regressione delle malattie correlate all’aterosclerosi utilizzando la colorazione Oil Red O dell’intera aorta9. La colorazione Red O dell’olio di aorta e la quantificazione della lesione s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato, in parte, da un Joint Biology Consortium Microgrant fornito nell’ambito della sovvenzione NIH P30AR070253 (P.-Y.C.) e HL135582 (MS). Siamo grati a R. Webber e L. Coon per aver mantenuto i topi utilizzati in questo studio.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | DENVILLE | C2170 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 16% Formaldehyde | Polysciences | 18814-10 | |
| 70% ethanol | VWR | RC2546.70-5 | To clean the dissection tools |
| Black dissection wax | CR Scientific | C3541 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | Solvent for Tamoxifen |
| DNeasy Blood & Tissue kit | QIAGEN | 69506 | To isolate DNA from mouse ear |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (1X DPBS), pH 7.4 | Gibco | 14190-144 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | |
| High cholesterol high fat diet | Research Diets | D12108 | To induce atherosclerosis |
| Imaging software | National Institutes of Health | Image J | Aortic lesion quantification |
| Isopropanol | VWR | JT9079-5 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | To clean the glass microscope slides |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | ROBOZ | RS-5602 | To separate the heart and the aorta and to cut open the aorta and aorta branches |
| Microscope control software | Olympus | DP Controller | For aorta imaging |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Needle-25G | BD | 305124 | |
| NonWoven Sponge | McKesson | 94442000 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | To stain the atherosclerosis lesions |
| Pall Acrodisc Sterile Syringe Filters with Super Membrane | VWR | 28143-312 | To filter working Oil Red O solution |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15021-15 | To dissect and clean the aorta |
| Statistical software | GraphPad | Prism 8 | Statical analysis |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | For aorta dissection |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | For aorta imaging |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | To induce Cre-loxP recombination |
| Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek | VWR | 25608-930 | |
| Tweezer Style 4 | Electron Microscopy Sciences | 0302-4-PO | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Tweezer Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 0302-5-PO | To dissect and clean the aorta |
References
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