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Médecine

Applicazione di un sistema di bioreattore tridimensionale di stimolazione meccanica uniassiale per indurre la differenziazione tenogena delle cellule staminali derivate da Tendon

Published: August 01, 2020
doi:
10.3791/61278
, , , , , , ,
1Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School,University of Western Australia

Summary

Un sistema di bioreattore di stimolazione meccanica uniassiale tridimensionale è un bioreattore ideale per la differenziazione tenogenica-specifica delle cellule staminali derivate dal tendine e della formazione neo-tendina.

Abstract

La tendinopatia è una comune malattia cronica del tendine a cui si tratta di infiammazione e degenerazione in un’area ortopedica. Con un’elevata morbilità, una limitata capacità di auto-riparazione e, soprattutto, senza trattamenti definitivi, la tendinopatia influenza ancora negativamente la qualità della vita dei pazienti. Le cellule staminali derivate dal tendone (TDSC), come cellule precursori primarie delle cellule tendisuotiche, svolgono un ruolo essenziale sia nello sviluppo della tendinopatia, sia nel ripristino funzionale e strutturale dopo la tendinopatia. Pertanto, sarebbe utile un metodo che può in vitro imitare la differenziazione in vivo dei TDSC nelle cellule tendinee. Qui, il presente protocollo descrive un metodo basato su un sistema di stretching uniaxial tridimensionale (3D) per stimolare i TDSC a differenziarsi in tessuti simili a quelli tendoni. Ci sono sette stadi del protocollo attuale: isolamento dei topi TDSC, coltura ed espansione dei topi TDSC, preparazione del mezzo di coltura della stimolazione per la formazione di lamiere cellulari, formazione di lamiere cellulari mediante stimolazione in media, preparazione del costrutto di cellule staminali del tendine 3D, assemblaggio del complesso di stimolazione meccanica che si estende uniaxial e valutazione del tessuto tendineo stimolato meccanicamente stimolato in vitro. L’efficacia è stata dimostrata dall’istologia. L’intera procedura richiede meno di 3 settimane. Per promuovere la deposizione di matrici extracellulari, è stato utilizzato 4,4 mg/mL di acido ascorbico nel mezzo di coltura della stimolazione. Una camera separata con un motore lineare fornisce un carico meccanico accurato ed è portatile e facilmente regolabile, che viene applicato per il bioreattore. Il regime di carico nel protocollo attuale era di 4%, 0,25 Hz, 8 h, seguito da 16 h resto per 6 giorni. Questo protocollo potrebbe imitare la differenziazione cellulare nel tendine, che è utile per lo studio del processo patologico di tendinopatia. Inoltre, il tessuto tendineo è potenzialmente utilizzato per promuovere la guarigione del tendine in lesioni tendinee come un innesto autologo ingegnerizzato. Per riassumere, l’attuale protocollo è semplice, economico, riproducibile e valido.

Introduction

La tendinopatia è una delle lesioni sportive comuni. Si manifesta principalmente da dolore, gonfiore locale, diminuzione della tensione muscolare nella zona interessata, e disfunzione. L’incidenza della tendinopatia è elevata. La presenza di achille tendinopatia è più comune per i corridori di media e lunga distanza (fino al 29%), mentre la presenza di tendinopatia rotutare è anche alta negli atleti di pallavolo (45%), basket (32%), atletica leggera (23%), pallamano (15%) e calcio (13%)1 ,2,,,3,4. Tuttavia, a causa della limitata capacità di autoguarigione del tendine e della mancanza di trattamenti efficaci, la tendinopatia influenza ancora negativamente la vita dei pazienti6,7. Inoltre, la patogenesi della tendinopatia rimane poco chiara. Ci sono state molte indagini sulla sua patogenesi, principalmente tra cui “teoria dell’infiammazione”, “teoria della degenerazione”, “teoria dell’uso eccessivo”, e così via8. Attualmente, molti ricercatori credevano che la tendinopatia fosse dovuta al fallimento dell’autoriparazione ai microlesioni causati da un carico meccanico eccessivo delle esperienze tendineee9,10.

Le cellule staminali derivate dal tendone (TDSC), come cellule precursori primarie delle cellule tendiche, svolgono un ruolo essenziale nello sviluppo della tendinopatia e del ripristino funzionale e strutturale dopo la tendinopatia11,12,13. È stato riferito che la stimolazione meccanica dello stress potrebbe causare la proliferazione e la differenziazione di osteociti, osteoblasti, cellule muscolari lisce, fibroblasti, cellule staminali mesenchymal e altre cellule sensibili alla forza14,15,1616,17,18. Pertanto, i TDSC, come una delle cellule meccanosensibili e multipotenti, possono essere stimolati a differenziarsi con il caricamento meccanico19,20.

Tuttavia, diversi parametri di caricamento meccanico (forza di caricamento, frequenza di caricamento, tipo di caricamento e periodo di caricamento) possono indurre i TDSC a differenziarsi in diverse celle21. Pertanto, un regime di carico meccanico efficace e valido è molto significativo per la tenogenesi. Inoltre, esistono diversi tipi di bioreattori come sistemi di stimolazione attualmente utilizzati per fornire carico meccanico ai TDSC. I principi di ogni tipo di bioreattore sono diversi, quindi anche i parametri di caricamento meccanico corrispondenti ai diversi bioreattori sono diversi. Pertanto, è richiesto un protocollo di stimolazione semplice, economico e riproducibile, che include il tipo di bioreattore, il mezzo di stimolazione corrispondente e il regime di carico meccanico.

Il presente articolo descrive un metodo basato su un sistema di stretching uniassiale tridimensionale (3D) per stimolare i TDSC a differenziarsi in tessuto tendineo. Ci sono sette fasi del protocollo: isolamento dei topi TDSC, coltura ed espansione dei topi TDSC, preparazione del mezzo di coltura di stimolazione per la formazione di lamiere cellulari, formazione di lamiere cellulari mediante coltura nel mezzo di stimolazione, preparazione del costrutto di cellule staminali 3D, assemblaggio del complesso di stimolazione meccanica allungamento uniaxiale e valutazione del tessuto tendineo stimolato meccanicamente stimolato in vitro. L’intera procedura richiede meno di 3 settimane per ottenere il costrutto di cella 3D, che è molto meno di alcuni metodi esistenti22,23. Il presente protocollo ha dimostrato di essere in grado di indurre i TDSC a differenziarsi in tessuto tendineo, ed è più affidabile dell’attuale sistema di stretching bidimensionale (2D) comunemente usato21. L’efficacia è stata dimostrata dall’istologia. In breve, il presente protocollo è semplice, economico, riproducibile e valido.

Protocol

I metodi descritti sono stati approvati ed eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti del Comitato Etico Animale dell’Università dell’Australia Occidentale. 1. Isolamento dei topi TDSC Eutanasia i topi C57BL/6 di 6-8 settimane da lussazione cervicale. Tendini rotulare di raccolta24 e tendini di Achille25. Tendini digerivi da uno con 6 mL di collagenasi di tipo I (3 mg/mL) per 3 h.NOTA: Poiché la…

Representative Results

Prima della stimolazione meccanica, i TDSC erano cresciuti al 100% di confluenza in mezzo completo e mostravano una morfologia ultrastrutturale disorganizzata (Figura 2A). Dopo 6 giorni di carico meccanico di stretching uniassiale, matrice extracellulare (ECM) e allineamenti cellulari erano ben orientati (Figura 2B). Le celle erano ben popolate e ben avvolte in ECM dopo il caricamento meccanico. La morfologia cellulare è stata presentata per essere allungata ed era più simile alla norm…

Discussion

Il tendine è un tessuto connettivo fibroso meccanosensibile. Secondo precedenti ricerche, l’eccesso di carico meccanico potrebbe portare a differenziazione osteogenica delle cellule staminali del tendine, mentre un carico insufficiente porterebbe a una struttura disordinata della fibra di collagene durante la differenziazione del tendine21.

Una visione comune è che la chiave per un bioreattore ideale è la capacità di simulare il microambiente cellulare in vitro a cu…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La ricerca è stata condotta mentre l’autore stava ricevimentando “una borsa di studio della University of Western Australia International Fee e un premio post-laurea dell’Università dell’Australia Occidentale”. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81802214).

Materials

Ascorbic acid Sigma-aldrich PHR1008-2G
Fetal bovine serum (FBS) Gibcoä by Life Technologies 1908361
Histology processor Leica TP 1020
Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) Gibcoä by Life Technologies 2003802
Mouse Tendon Derived Stem Cell Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions.
Paraformaldehyde Sigma-aldrich 441244
Streptomycin and penicillin mixture Gibcoä by Life Technologies 15140122
Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809
Trypsin Gibcoä by Life Technologies 1858331
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Citer Cet Article
Chen, Z., Chen, P., Ruan, R., Chen, L., Yuan, J., Wood, D., Wang, T., Zheng, M. H. Applying a Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System to Induce Tenogenic Differentiation of Tendon-Derived Stem Cells. J. Vis. Exp. (162), e61278, doi:10.3791/61278 (2020).
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