Bruke et tredimensjonalt uniaxial mekanisk stimulering bioreactor system for å indusere tenogen differensiering av sene-avledede stamceller

Summary

Et tredimensjonalt uniaxial mekanisk stimulering bioreaktorsystem er en ideell bioreaktor for tenogen-spesifikk differensiering av sene-avledede stamceller og neo-senedannelse.

Abstract

Tendinopati er en vanlig kronisk senesykdom knyttet til betennelse og degenerasjon i et ortopedisk område. Med høy sykelighet, begrenset selvreparerende kapasitet og, viktigst, ingen definitive behandlinger, påvirker tendinopati fortsatt pasientenes livskvalitet negativt. Sene-avledede stamceller (TDSCs), som primære forløperceller av seneceller, spiller en viktig rolle i både utviklingen av tendinopati, og funksjonell og strukturell restaurering etter tendinopati. Dermed vil en metode som in vitro etterligne in vivo differensiering av TDSCer i seneceller være nyttig. Her beskriver den nåværende protokollen en metode basert på et tredimensjonalt (3D) uniaxial stretching system for å stimulere TDSCs å differensiere til senelignende vev. Det er syv stadier av den nåværende protokollen: isolering av mus TDSCs, kultur og utvidelse av mus TDSCs, utarbeidelse av stimulering kultur medium for celleplatedannelse, cellearkdannelse ved kulturing i stimuleringsmedium, utarbeidelse av 3D sene stamcellekonstruksjon, montering av det uniaxial-stretching mekaniske stimuleringskomplekset, og evaluering av det mekaniske stimulerte in vitro senelignende vevet. Effektiviteten ble demonstrert av histologi. Hele prosedyren tar mindre enn 3 uker. For å fremme ekstracellulær matrisedeponering ble 4,4 mg/ml askorbinsyre brukt i stimuleringskulturmediet. Et separert kammer med en lineær motor gir nøyaktig mekanisk lasting og er bærbar og lett justert, som brukes for bioreaktoren. Lasteregimet i den nåværende protokollen var 6% belastning, 0,25 Hz, 8 h, etterfulgt av 16 h hvile i 6 dager. Denne protokollen kan etterligne celledifferensiering i senen, noe som er nyttig for undersøkelse av den patologiske prosessen med tendinopati. Videre, sene-lignende vev er potensielt brukt til å fremme sene healing i sene skade som en konstruert autolog graft. For å oppsummere er den nåværende protokollen enkel, økonomisk, reproduserbar og gyldig.

Introduction

Tendinopati er en av de vanlige idrettsskadene. Det manifesteres hovedsakelig av smerte, lokal hevelse, redusert muskelspenning i det berørte området og dysfunksjon. Forekomsten av tendinopati er høy. Tilstedeværelsen av Achilles tendinopati er mest vanlig for mellom- og langdistanseløpere (opptil 29%), mens tilstedeværelsen av patellar tendinopati er også høy i idrettsutøvere av volleyball (45%), basketball (32%), friidrett (23%), håndball (15%), og fotball (13%)^1,2,3,4,5. Men på grunn av den begrensede selvhelbredende evnen til senen, og mangelen på effektive behandlinger, påvirker tendinopati fortsatt pasientenes liv negativt^6,7. Videre er patogenesen av tendinopati fortsatt uklart. Det har vært mange undersøkelser om patogenesen, hovedsakelig inkludert “betennelsesteori”, “degenerasjonsteori”, “overforbruksteori”, og så videre⁸. I dag trodde mange forskere at tendinopati skyldtes den mislykkede selvreparasjonen til mikroskadene forårsaket av overdreven mekanisk lasting av seneopplevelsene^9,10.

Sene-avledede stamceller (TDSCs), som primære forløperceller av seneceller, spiller en viktig rolle i både utvikling av tendinopati og funksjonell og strukturell restaurering etter tendinopati^11,12,13. Det ble rapportert at mekanisk stressstimulering kan føre til spredning og differensiering av osteocytter, osteoblaster, glatte muskelceller, fibroblaster, mesenchymale stamceller og andre kraftfølsomme celler^{14,15,16,17,18}. Derfor kan TDSCer, som en av mekanosensitive og multipotente celler, på samme måte stimuleres til å skille ved mekanisk lasting^19,20.

Imidlertid kan ulike mekaniske lasteparametere (lastestyrke, lastefrekvens, lastingstype og lastingsperiode) indusere TDSCer for å skille seg inn i forskjellige celler²¹. Dermed er et effektivt og gyldig mekanisk lastingsregime svært viktig for tenogenese. Videre er det forskjellige typer bioreaktorer som stimuleringssystemer som i dag brukes for å gi mekanisk lasting til TDSCs. Prinsippene for hver type bioreaktor er forskjellige, så de mekaniske lasteparametrene som tilsvarer forskjellige bioreaktorer er også forskjellige. Derfor er en enkel, økonomisk og reproduserbar stimuleringsprotokoll etterspurt, inkludert typen bioreaktor, det tilsvarende stimuleringsmediet og det mekaniske lasteregimet.

Den nåværende artikkelen beskriver en metode basert på et tredimensjonalt (3D) uniaxial stretching system for å stimulere TDSCs å skille seg inn i senelignende vev. Det er syv stadier av protokollen: isolering av mus TDSCer, kultur og utvidelse av mus TDSCer, utarbeidelse av stimulering kultur medium for celleplatedannelse, cellearkdannelse ved kulturing i stimuleringsmedium, utarbeidelse av 3D sene stamcellekonstruksjon, montering av uniaxial-stretching mekanisk stimulering kompleks, og evaluering av mekanisk stimulert in vitro senelignende vev. Hele prosedyren tar mindre enn 3 uker å få 3D-cellekonstruksjonen, som er langt mindre enn noen eksisterende metoder^22,23. Den nåværende protokollen har vist seg å være i stand til å indusere TDSCer å skille seg inn i senevev, og det er mer pålitelig enn dagens brukte todimensjonale (2D) stretching system²¹. Effektiviteten ble demonstrert av histologi. Kort sagt, den nåværende protokollen er enkel, økonomisk, reproduserbar og gyldig.

Protocol

Metodene som er beskrevet ble godkjent og utført i samsvar med retningslinjene og forskriftene til University of Western Australia Animal Ethics Committee. 1. Isolering av mus TDSCer Euthanize den 6-8 uker gamle C57BL/6 mus ved cervical dislokasjon. Harvest patellar sener24 og Achilles sener25. Fordøy sener fra en med 6 ml av type I collagenase (3 mg/ml) i 3 timer.MERK: Siden størrelsen på senen i musen er li…

Representative Results

Før mekanisk stimulering ble TDSCs dyrket til 100% samløpet i komplett medium og viste en uorganisert ultrastrukturell morfologi (figur 2A). Etter 6 dager med uniaxial strekking mekanisk lasting, ekstracellulær matrise (ECM) og celle justeringer var godt orientert (Figur 2B). Cellene var godt befolket og godt innhyllet i ECM etter mekanisk lasting. Cellemorfologi ble presentert for å være langstrakt og var mer lik normal senecelle sammenlignet med den uten strekking (figur 2…

Discussion

Senen er et mekanosensitivt fibrøs bindevev. Ifølge tidligere forskning, overflødig mekanisk lasting kan føre til osteogen differensiering av sene stamceller, mens utilstrekkelig lasting ville føre til uorden kollagen fiber struktur under sene differensiering²¹.

Et vanlig syn er at nøkkelen til en ideell bioreaktor er evnen til å simulere in vitro cellulær mikromiljø som celler in vivo gjennomgår. Derfor, etterligne in vivo normal stress miljø in vitro er nø…

Materials

Ascorbic acid	Sigma-aldrich	PHR1008-2G
Fetal bovine serum (FBS)	Gibcoä by Life Technologies	1908361
Histology processor	Leica	TP 1020
Minimal Essential Medium (Alpha-MEM)	Gibcoä by Life Technologies	2003802
Mouse Tendon Derived Stem Cell			Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions.
Paraformaldehyde	Sigma-aldrich	441244
Streptomycin and penicillin mixture	Gibcoä by Life Technologies	15140122
Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System	Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia		Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809
Trypsin	Gibcoä by Life Technologies	1858331