Aplicando um sistema bioreator de estimulação mecânica uniaxial tridimensional para induzir a diferenciação tenogênica de células-tronco derivadas do tendão
Summary
Um sistema bioreator de estimulação mecânica uniaxial tridimensional é um bioreator ideal para diferenciação tenogênica específica de células-tronco derivadas do tendão e formação de neo-tendões.
Abstract
Tendinopatia é uma doença crônica comum relacionada à inflamação e degeneração em uma área ortopédica. Com alta morbidade, capacidade limitada de auto-reparação e, o mais importante, sem tratamentos definitivos, a tendinopatia ainda influencia negativamente a qualidade de vida dos pacientes. As células-tronco derivadas do tendão (TDSCs), como células precursoras primárias das células tendinosas, desempenham um papel essencial tanto no desenvolvimento da tendinopatia, quanto na restauração funcional e estrutural após a tendinopatia. Assim, um método que pode imitar in vitro a diferenciação in vivo de TDSCs em células tendinosas seria útil. Aqui, o presente protocolo descreve um método baseado em um sistema de alongamento uniaxial tridimensional (3D) para estimular os TDSCs a se diferenciarem em tecidos semelhantes a tendões. São sete estágios do presente protocolo: isolamento de TDSCs camundongos, cultura e expansão de TDSCs de camundongos, preparação de meio de cultura de estimulação para formação de folhas de células, formação de folhas de células por cultivo em meio de estimulação, preparação de construção de células-tronco tendinosas 3D, montagem do complexo de estimulação mecânica de alongamento uniaxial e avaliação do tecido mecânico estimulado in vitro como tendão. A eficácia foi demonstrada pela histologia. Todo o procedimento leva menos de 3 semanas. Para promover a deposição da matriz extracelular, utilizou-se ácido ascórbico de 4,4 mg/mL no meio da cultura de estimulação. Uma câmara separada com motor linear fornece carregamento mecânico preciso e é portátil e facilmente ajustada, que é aplicada para o bioreator. O regime de carregamento no presente protocolo foi de 6% de tensão, 0,25 Hz, 8h, seguido de repouso de 16h durante 6 dias. Esse protocolo poderia imitar a diferenciação celular no tendão, o que é útil para a investigação do processo patológico da tendinopatia. Além disso, o tecido semelhante ao tendão é potencialmente usado para promover a cicatrização do tendão na lesão tendinosa como um enxerto autólogo projetado. Resumindo, o presente protocolo é simples, econômico, reproduzível e válido.
Introduction
Tendinopatia é uma das lesões esportivas comuns. Manifesta-se principalmente por dor, inchaço local, diminuição da tensão muscular na área afetada e disfunção. A incidência de tendinopatia é alta. A presença de tendinopatia de Aquiles é mais comum para corredores de média e longa distância (até 29%), enquanto a presença de tendinopatia patelar também é alta em atletas de vôlei (45%), basquete (32%), atletismo (23%), handebol (15%) e futebol (13%)1,2,,3,,4,5. No entanto, devido à limitada capacidade de auto-cura do tendão e à falta de tratamentos eficazes, a tendinopatia ainda influencia negativamente a vida dos pacientes6,7. Além disso, a patogênese da tendinopatia permanece incerta. Tem havido muitas investigações sobre sua patogênese, principalmente incluindo “teoria da inflamação”, “teoria da degeneração”, “teoria do uso excessivo”, e assim por diante8. Atualmente, muitos pesquisadores acreditavam que a tendinopatia era devido à falha no auto-reparo das micro-lesões causadas pelo carregamento mecânico excessivo das experiências tendinosas9,,10.
As células-tronco derivadas do tendão (TDSCs), como células precursoras primárias das células tendinosas, desempenham um papel essencial tanto no desenvolvimento da tendinopatia quanto na restauração funcional e estrutural após tendinopatia11,,12,,13. Foi relatado que a estimulação do estresse mecânico poderia causar a proliferação e diferenciação de osteocitos, osteoblastos, células musculares lisas, fibroblastos, células-tronco mesenquimais e outras células sensíveis à força14,,15,,16,,17,18. Portanto, os TDSCs, como uma das células mecanosensíveis e multipotentes, podem ser estimulados a diferenciar-se por carregamento mecânico19,,20.
No entanto, diferentes parâmetros de carga mecânica (força de carga, frequência de carga, tipo de carga e período de carregamento) podem induzir TDSCs a se diferenciar em diferentes células21. Assim, um regime de carregamento mecânico eficaz e válido é muito significativo para a tenogênese. Além disso, existem diferentes tipos de bioreatores como sistemas de estimulação atualmente utilizados para fornecer carregamento mecânico para TDSCs. Os princípios de cada tipo de bioreator são diferentes, de modo que os parâmetros de carregamento mecânico correspondentes a diferentes bioreatores também são diferentes. Portanto, é procurado um protocolo de estimulação simples, econômico e reprodutível, incluindo o tipo de bioreator, o meio de estimulação correspondente e o regime de carga mecânica.
O presente artigo descreve um método baseado em um sistema de alongamento uniaxial tridimensional (3D) para estimular os TDSCs a se diferenciarem em tecido semelhante ao tendão. São sete estágios do protocolo: isolamento de TDSCs camundongos, cultura e expansão de TDSCs de camundongos, preparação de cultura de estimulação para formação de folhas de células, formação de folhas de células por cultivo em meio de estimulação, preparação de construção de células-tronco tendinosas 3D, montagem do complexo de estimulação mecânica de alongamento uniaxial e avaliação do tecido mecânico estimulado in vitro. Todo o procedimento leva menos de 3 semanas para obter o construto de células 3D, que é muito menor do que alguns métodos existentes22,23. O presente protocolo tem sido provado ser capaz de induzir TDSCs a diferenciar-se em tecido tendão, e é mais confiável do que o sistema de alongamento bidimensional (2D) atualmente usado21. A eficácia foi demonstrada pela histologia. Em suma, o presente protocolo é simples, econômico, reproduzível e válido.
Protocol
Representative Results
Discussion
O tendão é um tecido conjuntivo fibroso mecanosensível. De acordo com pesquisas anteriores, o excesso de carga mecânica poderia levar à diferenciação osteogênica das células-tronco tendinosas, enquanto o carregamento insuficiente levaria à estrutura de fibra de colágeno desordenada durante a diferenciação do tendão21.
Uma visão comum é que a chave para um bioreator ideal é a capacidade de simular o microambiente celular in vitro que as células in vivo …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A pesquisa foi realizada enquanto o autor estava recebendo “uma Bolsa de Estudos de Taxa Internacional da Universidade da Austrália Ocidental e um Prêmio de Pós-Graduação universitária na Universidade da Austrália Ocidental”. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81802214).
Materials
| Ascorbic acid | Sigma-aldrich | PHR1008-2G | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibcoä by Life Technologies | 1908361 | |
| Histology processor | Leica | TP 1020 | |
| Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) | Gibcoä by Life Technologies | 2003802 | |
| Mouse Tendon Derived Stem Cell | Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions. | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | 441244 | |
| Streptomycin and penicillin mixture | Gibcoä by Life Technologies | 15140122 | |
| Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System | Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia | Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809 | |
| Trypsin | Gibcoä by Life Technologies | 1858331 |
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