مجتمعة في فيفو التشريحية والوظيفية تتبع من محطات الغلوتامات منطقة البطن في قرن آمون
Summary
يوضح البروتوكول الحالي طريقة بسيطة لتتبع إسقاطات الغلوتامات للمنطقة البطنية (VTA) إلى قرن آمون. تم الجمع بين التحفيز الضوئي للخلايا العصبية الغلوتامات VTA مع تسجيل CA1 لإظهار كيفية محطات الغلوتامات VTA تعدل CA1 معدل إطلاق الهرمي المفترض في الجسم الحي.
Abstract
وقد سمح التشكيل البصري للخلايا العصبية الفرعية في الدماغ للباحثين بتشريح الدوائر العصبية في الجسم الحي وفيفو السابق. وهذا يوفر فرضية لتحديد دور أنواع الخلايا العصبية داخل الدائرة العصبية، وأهميتها في ترميز المعلومات بالنسبة للتعلم. وبالمثل، يمكن استخدام هذه الطريقة لاختبار الأهمية الفسيولوجية لاثنين أو أكثر من مناطق الدماغ المتصلة في الحيوانات المستيقظة والمخدرة. توضح الدراسة الحالية كيف تعدل الخلايا العصبية الغلوتامات VTA معدل إطلاق الخلايا العصبية الهرمية المفترضة في CA1 (قرن آمون) من الفئران المخدرة. يستخدم هذا البروتوكول الوسم المرتبط بالفيروسات (AAV) المعتمد على VTA الخلايا العصبية الغلوتامات لتتبع محطات الغلوتامات المبتسرة في طبقات قرن آمون. التعبير عن الأوبسين التي تسيطر عليها الضوء (channelrhodopsin; hChR2) وبروتين الفلورية (eYFP) التي تؤويها ناقلات AAV يسمح تتبع أنتيروزغراد من محطات الغلوتامات VTA, والتشويه الضوئي من VTA الجلوتامات الخلايا العصبية الهيئات (في VTA). تم وضع أقطاب السيليكون الحادة عالية المقاومة في CA1 للكشف عن استجابات متعددة الوحدات ووحدة واحدة للتحوير الضوئي VTA في الجسم الحي. تظهر نتائج هذه الدراسة التوزيع المعتمد على الطبقة لمحطات الغلوتامات VTA المشبكية في قرن آمون (CA1 و CA3 و DG). أيضا، فإن التحفيز الضوئي للخلايا العصبية الغلوتامات VTA زيادة معدل إطلاق النار وانفجار وحدات هرمية CA1 المفترضة في الجسم الحي.
Introduction
في العقد الماضي، تم تطوير مجموعة من الأدوات الوراثية لزيادة خصوصية التشكيل من نوع الخلايا العصبية، ورسم خرائط الشبكات العصبية المعقدة1. وتجدر الإشارة إلى أن الفيروسات العصبية ذات القدرة المتأصلة على العدوى والتكاثر في الخلايا العصبية قد تم نشرها للتعبير عن أو إلغاء بروتينات محددة في الأنواع الفرعية من الخلايا العصبية. عند إيواء البروتينات الفلورية أو مؤشرات النشاط المتشابك المشفرة وراثيا ، تسمية ناقلات AAV المصابة وتحديد الشبكات العصبية عبر مناطق الدماغ2،3. اختيار المروج في بناء AAV يوجه التعبير عن المتجه في أنواع الخلايا العصبية مع مستوى معين من خصوصية (التعبيرالمعتمد على المروج). ومع ذلك، من خلال إعادة تركيب Cre-lox، يتم نشر بناء AAV مع خصوصية أكبر لوضع العلامات العصبية4،5 ،6،7. من الجدير بالذكر، يمكن التعبير عن opsins الميكروبية النشطة ضوئيا والبروتينات الفلورية المعبأة في ناقلات AAV في الأنواع الفرعية المختلفة من الخلايا العصبية8،وهي مثالية للتصوير، وتتبع الدوائر من نوع الخلايا العصبية، والتحوير الضوئي9،10.
AAVs يبني حقن مجسمة في منطقة الدماغ (أو نواة) يدفع التعبير عن البروتين مراسل في سوما، dendrite، ومحطات المحاور. التعبير العصبي للAV إيواء الجينات مراسل (eYFP) يسهل وضع العلامات على أجسام الخلايا العصبية وتتبع التشريحية من التوقعات من وإلى مناطق الدماغ الأخرى11,12,13,14. AAV-eYFP يبني تحمل opsin الضوء التي تسيطر عليها (على سبيل المثال، hChR2)، يمكن نشرها كأداة للتصوير6،15 والتحفيز القائم على تتبع الفسيولوجية من التوقعات العصبية لاستهداف مناطق الدماغ في الجسم الحي16. اعتمادا على النمط المصلي AAV، قد يكون اتجاه وضع العلامات العصبية قبل التحلل أوالرجعية 11،12. وقد أثبتت الدراسات السابقة أن AAV5 يسافر anterogradely في الخلايا العصبية12. وهكذا، فإن التحفيز الضوئي لأجسام الخلايا التي تعبر عن hChR2 ينتج تأثيرات متبصرة في مكان آخر في الدماغ (الهدف)17.
هنا، تم استخدام AAV (النمط المصلي 5) مع المروج CaMKIIα للتعبير عن eYFP (مراسل) وhChR2 (opsin) في الخلايا العصبية الغلوتامات VTA والتوقعات المحورية. تظهر نتائج هذه الدراسة التوزيع المعتمد على الطبقة لمحطات VTA-glutamate presynaptic في مناطق CA1 و CA3 و DG فرس النهر. أيضا، زيادة التحفيز الضوئي للخلايا العصبية الغلوتامات VTA CA1 متعددة وحدة ووحدة واحدة معدلات إطلاق النار في الجسم الحي بالمقارنة مع القيم الأساسية. يستخدم هذا البروتوكول أدوات ميسورة التكلفة وبرامج متاحة تجاريا يمكن أن تزيد من جودة البيانات التي تم الحصول عليها من تجارب تتبع الدوائر العصبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في العقد الماضي ، تقدم تصميم بنى AAV بشكل كبير. على هذا النحو، تم دمج المزيد من المروجين الخلايا العصبية محددة في مجموعة من الأنماط المصلية AAV لتحسين خصوصية العدوى14. من خلال الجمع بين الجينات للبروتينات الفلورية، والنقل، والمستقبلات، والقنوات الأيونية، توجد الآن مكتبات AAV للتص…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم تمويل هذا العمل من قبل CBS بريدجينج غرانت الممنوحة ل OOM. قام OOM و PAA و AS بتصميم الدراسة وإجراء التجارب. AS وPAA تحليل النتائج. أعد أوم وPAA المخطوطة. نشكر الدكتور كارل ديسروث (جامعة ستانفورد) على إتاحة AAV لاستخدامنا.
Materials
| 3% Hydrogen peroxide | Fisher chemical | H312 | |
| AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP | Addgene | Plasmid #26969 | |
| BNC cable | Amazon | ||
| BNC Splitter | Amazon | ||
| Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25mm Ferrules. | Thorlabs | ADAL1-5 | |
| Drill | Dremel | LR 39098 | |
| Gelatin coated slides | Fisher scientific | OBSLD01CS | |
| Hamilton's syringe (Neuros) | WPI Inc. | 06H | |
| Head stage adapter | Neuronexus | Adpt-Q4-OM32 | |
| High impedance silicon probe | Neuronexus | Q1x1-tet-5mm-121-CQ4 | |
| INTAN 512ch Recording Controller | INTAN | RHD2000 | |
| Iodine solution | Dynarex | 1425 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| Ketamine | Spectrum | K1068 | |
| LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
| LED light source (470 nm)-blue light | Thorlabs | M470F3 | |
| Micromanipulator | Narishige | M0-203 | |
| Optic fiber | Thorlabs | CFMLC14L05 | |
| Pan head philips screw (M0.6 X 2mm) | Amazon | M0.6 X 2mm | |
| Pre-amplifier headstage (32 Channel) | INTAN | C3314 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | 1530 | |
| TTL pulser | Prizmatix | 4031 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Xylazine | Alfa Aesar | J61430 | |
| Software | Company | Version | |
| Graphpad Prism | |||
| Intan Recording Controller | |||
| Neuroexplorer | |||
| Plexon Offline Spike Sorter | |||
| ACSF Composition: | |||
| oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO2 constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 and 25 Glucose). |
References
- Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72 (6), 938-950 (2011).
- Li, J., Liu, T., Dong, Y., Kondoh, K., Lu, Z. Trans-synaptic Neural Circuit-Tracing with Neurotropic Viruses. Neuroscience bulletin. , 1-12 (2019).
- Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
- Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
- Dragatsis, I., Zeitlin, S. A method for the generation of conditional gene repair mutations in mice. Nucleic acids research. 29 (3), 10 (2001).
- Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
- Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends in cognitive sciences. 15 (12), 592-600 (2011).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251 (2012).
- Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
- Kohara, K., et al. Cell type-specific genetic and optogenetic tools reveal hippocampal CA2 circuits. Nature Neuroscience. 17 (2), 269 (2014).
- Gombash, S. E. Adeno-Associated Viral Vector Delivery to the Enteric Nervous System: A Review. Postdoc Journal. 3 (8), 1-12 (2015).
- Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-Associated Viral Vectors in Neuroscience Research. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
- Montardy, Q., et al. Characterization of glutamatergic VTA neural population responses to aversive and rewarding conditioning in freely-moving mice. Science Bulletin. 64 (16), 1167-1178 (2019).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
- Zingg, B., et al. AAV-mediated anterograde transsynaptic tagging: mapping corticocollicular input-defined neural pathways for defense behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
- Wang, C., Wang, C., Clark, K., Sferra, T. Recombinant AAV serotype 1 transduction efficiency and tropism in the murine brain. Gene therapy. 10 (17), 1528 (2003).
- Ahlgrim, N. S., Manns, J. R. Optogenetic Stimulation of the Basolateral Amygdala Increased Theta-Modulated Gamma Oscillations in the Hippocampus. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 87 (2019).
- Buzsaki, G., et al. Tools for probing local circuits: high-density silicon probes combined with optogenetics. Neuron. 86 (1), 92-105 (2015).
- Benardo, L. S., Prince, D. A. Dopamine action on hippocampal pyramidal cells. Journal of Neuroscience. 2 (4), 415-423 (1982).
- Davidow, J. Y., Foerde, K., Galvan, A., Shohamy, D. An Upside to Reward Sensitivity: The Hippocampus Supports Enhanced Reinforcement Learning in Adolescence. Neuron. 92 (1), 93-99 (2016).
- Hu, H. Reward and Aversion. Annual Review of Neuroscience. 39, 297-324 (2016).
- Kahn, I., Shohamy, D. Intrinsic connectivity between the hippocampus, nucleus accumbens, and ventral tegmental area in humans. Hippocampus. 23 (3), 187-192 (2013).
- Lisman, J. E. Relating hippocampal circuitry to function: recall of memory sequences by reciprocal dentate-CA3 interactions. Neuron. 22 (2), 233-242 (1999).
- Lisman, J. E., Grace, A. A. The hippocampal-VTA loop: controlling the entry of information into long-term memory. Neuron. 46 (5), 703-713 (2005).
- Broussard, J. I., et al. Dopamine Regulates Aversive Contextual Learning and Associated In Vivo Synaptic Plasticity in the Hippocampus. Cell Reports. 14 (8), 1930-1939 (2016).
- Hansen, N., Manahan-Vaughan, D. Dopamine D1/D5 receptors mediate informational saliency that promotes persistent hippocampal long-term plasticity. Cerebral Cortex. 24 (4), 845-858 (2014).
- Salvetti, B., Morris, R. G., Wang, S. H. The role of rewarding and novel events in facilitating memory persistence in a separate spatial memory task. Learning & Memory. 21 (2), 61-72 (2014).
- Ntamati, N. R., Luscher, C. VTA Projection Neurons Releasing GABA and Glutamate in the Dentate Gyrus. eNeuro. 3 (4), (2016).
- Yoo, J. H., et al. Ventral tegmental area glutamate neurons co-release GABA and promote positive reinforcement. Nature Communications. 7, 13697 (2016).
- Funahashi, S. Working Memory in the Prefrontal Cortex. Brain Sciences. 7 (5), (2017).
- Luo, A. H., Tahsili-Fahadan, P., Wise, R. A., Lupica, C. R., Aston-Jones, G. Linking context with reward: a functional circuit from hippocampal CA3 to ventral tegmental area. Science. 333 (6040), 353-357 (2011).
- McNamara, C. G., Dupret, D. Two sources of dopamine for the hippocampus. Trends in Neurosciences. 40 (7), 383-384 (2017).
- McNamara, C. G., Tejero-Cantero, A., Trouche, S., Campo-Urriza, N., Dupret, D. Dopaminergic neurons promote hippocampal reactivation and spatial memory persistence. Nature Neuroscience. 17 (12), 1658-1660 (2014).
- Cardin, J. A., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nature Protocols. 5 (2), 247-254 (2010).
- Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
- Zingg, B., et al. AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
- Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
- Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).
- Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V. Two-photon optogenetics. Progress in Brain Research. 196, 119-143 (2012).
