JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Neurosciences

Kombineret i Vivo Anatomisk og funktionel sporing af Ventral Tegmental Area Glutamat Terminaler i Hippocampus

Published: September 09, 2020
doi:
10.3791/61282
, ,
1Department of Comparative Biomedical Sciences,Louisiana State University School of Veterinary Medicine

Summary

Den nuværende protokol demonstrerer en enkel metode til sporing af ventral tegmental område (VTA) glutamat fremskrivninger til hippocampus. Photostimulation af VTA glutamat neuroner blev kombineret med CA1 optagelse for at demonstrere, hvordan VTA glutamat terminaler modulere CA1 formodede pyramide fyring sats in vivo.

Abstract

Optogenetisk graduering af neuron subpopulationer i hjernen har gjort det muligt for forskere at dissekere neurale kredsløb in vivo og ex vivo. Dette giver en forudsætning for at bestemme neurontypernes rolle i et neuralt kredsløb og deres betydning i informationskodning i forhold til læring. Ligeledes kan metoden bruges til at teste den fysiologiske betydning af to eller flere forbundne hjerneregioner i vågne og bedøvede dyr. Den nuværende undersøgelse viser, hvordan VTA glutamat neuroner modulere fyring sats formodede pyramide neuroner i CA1 (hippocampus) af bedøvede mus. Denne protokol anvender adeno-associeret virus (AAV) afhængig mærkning af VTA glutamat neuroner til sporing af VTA presynaptic glutamat terminaler i lagene af hippocampus. Ekspression af lysstyret opsin (channelrhodopsin; hChR2) og fluorescensprotein (eYFP), der næres af AAV-vektoren, tilladte anterograde-sporing af VTA glutamatterminaler og fototimulation af VTA glutamat neuroncellelegemer (i VTA). Høj impedans akutte silicium elektroder blev placeret i CA1 til at opdage multi-enhed og enkelt-enhed reaktioner på VTA photostimulation in vivo. Resultaterne af denne undersøgelse viser den lagafhængige fordeling af præsynaptiske VTA glutamatterminaler i hippocampus (CA1, CA3 og GD). Også, den photostimulation af VTA glutamat neuroner øget fyring og brast sats formodede CA1 pyramideenheder in vivo.

Introduction

I det sidste årti blev en række genetiske værktøjer udviklet for at øge specificiteten af neuron-type graduering og kortlægning af komplekse neurale netværk1. Især neurotropiske vira med en iboende evne til at inficere og replikere i neuronale celler er blevet indsat for at udtrykke eller ablate specifikke proteiner i neuron sub-typer. Når der huser fluorescens proteiner eller genetisk kodet synaptiske aktivitetsindikatorer, transfected AAV vektorer etiket og afgrænse neurale netværk på tværs af hjernen regioner2,3. Valget af en promotor i AAV-konstruktionen dirigerer vektorens udtryk i neurontyper med en vis specificitet(promotorafhængigt udtryk). Men gennem Cre-lox rekombination, AAV konstruktioner er indsat med større specificitet for neuron mærkning4,5,6,7. Bemærk, fotoaktiverede mikrobielle opsiner og fluorescensproteiner pakket i AAV-vektorer kan udtrykkes i forskellige neuronundertyper8og er ideelle til billeddannelse, neuron-type kredsløbssporing og fotomodulation9,10.

AAV’er konstruerer stereotaktisk injiceres i en hjerne region (eller kerne) drev udtryk for reporter protein i soma, dendrit, og axoner terminaler. Neurale udtryk for AAV huser en reporter gen (eYFP) letter mærkning af neuron celle organer og anatomiske sporing af fremskrivninger til og fra andre hjerne regioner11,12,13,14. AAV-eYFP konstruerer transporterer lys-kontrolleret opsin (f.eks hChR2), kan anvendes som et redskab til billeddannelse6,15 og stimulation-baserede fysiologiske sporing af neurale fremskrivninger til at målrette hjernen områder in vivo16. Afhængigt af AAV-serotypen kan retningen af neuronmærkning være anterograde eller retrograd11,12. Tidligere undersøgelser har fastslået, at AAV5 rejser anterogradely i neuroner12. Således photostimulation af celle organer udtrykke hChR2 producerer præsynaptiske virkninger andre steder i hjernen (mål)17.

Her blev AAV (serotype 5) med en CaMKIIα promotor brugt til at udtrykke eYFP (reporter) og hChR2 (opsin) i VTA glutamat neuroner og axonale fremskrivninger. Resultaterne fra denne undersøgelse viser den lagafhængige fordeling af præsynaptiske VTA-glutamatterminaler i CA1-, CA3- og GD hippocampal-regionerne. Også, photostimulation af VTA glutamat neuroner øget CA1 multi-enhed og enkelt-enhed fyring satser in vivo sammenlignet med baseline værdier. Denne protokol bruger overkommelige værktøjer og kommercielt tilgængelig software, der kan øge kvaliteten af data opnået fra neurale kredsløbssporingseksperimenter.

Protocol

Alle forsøgs- og dyrehåndteringsprocedurer blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra Louisiana State University School of Veterinary Medicine. 1. Forsøgsdyr Brug 5-6 uger gamle mus. Hus 3-5 dyr pr bur under standardbetingelser på 12 timer skiftevis lys og mørk cyklus. Mad og vand skal leveres ad libitum. 2. Kraniotomi og tilberedning af dyr BEMÆRK: I dette afsnit beskrives præ-…

Representative Results

Anterograde-sporing AAV-ekspressionen blev verificeret ved immunfluorescensbilleddannelse af reporterprotein (eYFP) i VTA for C57BL/6-mus 21 dage efter injektionen (figur 2). Vellykket anterograde mærkning af præsynaptiske VTA glutamat fremskrivninger i hippocampus blev også verificeret ved eYFP afsløring i lagene af GD, CA3, og CA1 (Figur 6a-d; Film 2 og 3). VT…

Discussion

I det seneste årti er designet af AAV-konstruktioner avanceret betydeligt. Som sådan er mere neuron-specifikke initiativtagere blevet indarbejdet i en række AAV-serotyper for forbedret transfektspecifikitet14. Ved at kombinere gener for fluorescensproteiner, transportører, receptorer og ionkanaler findes der nu biblioteker af AAV til billeddannelse, neuromodulation og synaptisk aktivitetsdetektion. I kommercielt tilgængelige AAV-konstruktioner giver en kombination af en genetisk kodet fluorop…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde er finansieret af CBS Bridging Grant tildelt OOM. OOM, PAA og AS designede undersøgelsen og udførte eksperimenterne. AS og PAA analyserede resultaterne. OOM og PAA forberedte manuskriptet. Vi takker Dr. Karl Disseroth (Stanford University) for at gøre AAV til rådighed for vores brug.

Materials

3% Hydrogen peroxide Fisher chemical H312
AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP Addgene Plasmid #26969
BNC cable Amazon
BNC Splitter Amazon
Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25mm Ferrules. Thorlabs ADAL1-5
Drill Dremel LR 39098
Gelatin coated slides Fisher scientific OBSLD01CS
Hamilton's syringe (Neuros) WPI Inc. 06H
Head stage adapter Neuronexus Adpt-Q4-OM32
High impedance silicon probe Neuronexus Q1x1-tet-5mm-121-CQ4
INTAN 512ch Recording Controller INTAN RHD2000
Iodine solution Dynarex 1425
Isoflurane Piramal NDC 66794-017-25
Ketamine Spectrum K1068
LED Driver Thorlabs LEDD1B
LED light source (470 nm)-blue light Thorlabs M470F3
Micromanipulator Narishige M0-203
Optic fiber Thorlabs CFMLC14L05
Pan head philips screw (M0.6 X 2mm) Amazon M0.6 X 2mm
Pre-amplifier headstage (32 Channel) INTAN C3314
Stereotaxic frame Kopf 1530
TTL pulser Prizmatix 4031
Urethane Sigma U2500
Xylazine Alfa Aesar J61430
Software Company Version
Graphpad Prism
Intan Recording Controller
Neuroexplorer
Plexon Offline Spike Sorter
ACSF Composition:
oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO2 constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 and 25 Glucose).
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72 (6), 938-950 (2011).
  2. Li, J., Liu, T., Dong, Y., Kondoh, K., Lu, Z. Trans-synaptic Neural Circuit-Tracing with Neurotropic Viruses. Neuroscience bulletin. , 1-12 (2019).
  3. Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
  4. Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
  5. Dragatsis, I., Zeitlin, S. A method for the generation of conditional gene repair mutations in mice. Nucleic acids research. 29 (3), 10 (2001).
  6. Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
  7. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends in cognitive sciences. 15 (12), 592-600 (2011).
  8. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251 (2012).
  9. Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
  10. Kohara, K., et al. Cell type-specific genetic and optogenetic tools reveal hippocampal CA2 circuits. Nature Neuroscience. 17 (2), 269 (2014).
  11. Gombash, S. E. Adeno-Associated Viral Vector Delivery to the Enteric Nervous System: A Review. Postdoc Journal. 3 (8), 1-12 (2015).
  12. Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-Associated Viral Vectors in Neuroscience Research. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
  13. Montardy, Q., et al. Characterization of glutamatergic VTA neural population responses to aversive and rewarding conditioning in freely-moving mice. Science Bulletin. 64 (16), 1167-1178 (2019).
  14. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  15. Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
  16. Zingg, B., et al. AAV-mediated anterograde transsynaptic tagging: mapping corticocollicular input-defined neural pathways for defense behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
  17. Wang, C., Wang, C., Clark, K., Sferra, T. Recombinant AAV serotype 1 transduction efficiency and tropism in the murine brain. Gene therapy. 10 (17), 1528 (2003).
  18. Ahlgrim, N. S., Manns, J. R. Optogenetic Stimulation of the Basolateral Amygdala Increased Theta-Modulated Gamma Oscillations in the Hippocampus. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 87 (2019).
  19. Buzsaki, G., et al. Tools for probing local circuits: high-density silicon probes combined with optogenetics. Neuron. 86 (1), 92-105 (2015).
  20. Benardo, L. S., Prince, D. A. Dopamine action on hippocampal pyramidal cells. Journal of Neuroscience. 2 (4), 415-423 (1982).
  21. Davidow, J. Y., Foerde, K., Galvan, A., Shohamy, D. An Upside to Reward Sensitivity: The Hippocampus Supports Enhanced Reinforcement Learning in Adolescence. Neuron. 92 (1), 93-99 (2016).
  22. Hu, H. Reward and Aversion. Annual Review of Neuroscience. 39, 297-324 (2016).
  23. Kahn, I., Shohamy, D. Intrinsic connectivity between the hippocampus, nucleus accumbens, and ventral tegmental area in humans. Hippocampus. 23 (3), 187-192 (2013).
  24. Lisman, J. E. Relating hippocampal circuitry to function: recall of memory sequences by reciprocal dentate-CA3 interactions. Neuron. 22 (2), 233-242 (1999).
  25. Lisman, J. E., Grace, A. A. The hippocampal-VTA loop: controlling the entry of information into long-term memory. Neuron. 46 (5), 703-713 (2005).
  26. Broussard, J. I., et al. Dopamine Regulates Aversive Contextual Learning and Associated In Vivo Synaptic Plasticity in the Hippocampus. Cell Reports. 14 (8), 1930-1939 (2016).
  27. Hansen, N., Manahan-Vaughan, D. Dopamine D1/D5 receptors mediate informational saliency that promotes persistent hippocampal long-term plasticity. Cerebral Cortex. 24 (4), 845-858 (2014).
  28. Salvetti, B., Morris, R. G., Wang, S. H. The role of rewarding and novel events in facilitating memory persistence in a separate spatial memory task. Learning & Memory. 21 (2), 61-72 (2014).
  29. Ntamati, N. R., Luscher, C. VTA Projection Neurons Releasing GABA and Glutamate in the Dentate Gyrus. eNeuro. 3 (4), (2016).
  30. Yoo, J. H., et al. Ventral tegmental area glutamate neurons co-release GABA and promote positive reinforcement. Nature Communications. 7, 13697 (2016).
  31. Funahashi, S. Working Memory in the Prefrontal Cortex. Brain Sciences. 7 (5), (2017).
  32. Luo, A. H., Tahsili-Fahadan, P., Wise, R. A., Lupica, C. R., Aston-Jones, G. Linking context with reward: a functional circuit from hippocampal CA3 to ventral tegmental area. Science. 333 (6040), 353-357 (2011).
  33. McNamara, C. G., Dupret, D. Two sources of dopamine for the hippocampus. Trends in Neurosciences. 40 (7), 383-384 (2017).
  34. McNamara, C. G., Tejero-Cantero, A., Trouche, S., Campo-Urriza, N., Dupret, D. Dopaminergic neurons promote hippocampal reactivation and spatial memory persistence. Nature Neuroscience. 17 (12), 1658-1660 (2014).
  35. Cardin, J. A., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nature Protocols. 5 (2), 247-254 (2010).
  36. Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
  37. Zingg, B., et al. AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
  38. Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
  39. Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).
  40. Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V. Two-photon optogenetics. Progress in Brain Research. 196, 119-143 (2012).

Tags

In Vivo TracingVentral Tegmental AreaGlutamate TerminalsHippocampusOptogeneticsStereotaxic SurgeryExtracellular RecordingAdeno-associated VirusNeurocircuitsNeural Pathways

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Shrestha, A., Adeniyi, P. A., Ogundele, O. M. Combined In Vivo Anatomical and Functional Tracing of Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in the Hippocampus. J. Vis. Exp. (163), e61282, doi:10.3791/61282 (2020).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image