JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurosciences

מעקב אנטומי ותפקודי משולב של מסופי גלוטמט באזור הגונטם הגחמני בהיפוקמפוס

Published: September 09, 2020
doi:
10.3791/61282
, ,
1Department of Comparative Biomedical Sciences,Louisiana State University School of Veterinary Medicine

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מדגים שיטה פשוטה להתחקות אחר תחזיות גלוטמט אזור טגמנטלי גחוני (VTA) להיפוקמפוס. פוטוטימולציה של נוירונים גלוטמט VTA שולב עם הקלטת CA1 כדי להדגים כיצד מסופי גלוטמט VTA לווסת CA1 קצב ירי פירמידלי putative ב vivo.

Abstract

אפנון אופטוגנטי של תת-אוכלוסיות נוירונים במוח אפשר לחוקרים לנתח מעגלים עצביים ב- vivo ו- ex vivo. זה מספק הנחת יסוד לקביעת התפקיד של סוגי נוירונים בתוך מעגל עצבי, ואת המשמעות שלהם בקידוד מידע ביחס ללמידה. כמו כן, השיטה יכולה לשמש כדי לבדוק את המשמעות הפיזיולוגית של שני אזורי מוח מחוברים או יותר בבעלי חיים ערים ומורדמים. המחקר הנוכחי מדגים כיצד נוירונים גלוטמט VTA לווסת את קצב הירי של נוירונים פירמידליים putative ב CA1 (היפוקמפוס) של עכברים מרדימים. פרוטוקול זה משתמש וירוס הקשורים אדנו (AAV) תיוג תלוי של נוירונים גלוטמט VTA להתחקות אחר מסופי גלוטמט פרסינפטי VTA בשכבות של ההיפוקמפוס. ביטוי של אופסין מבוקר אור (channelrhodopsin; hChR2) וחלבון פלואורסצנטי (eYFP) המוחזק על ידי וקטור AAV מותר מעקב אנטרוגרד של מסופי גלוטמט VTA, ו photostimulation של גופי תאי נוירון גלוטמט VTA (ב- VTA). אלקטרודות סיליקון חריפות בעלותעכבה גבוהה הוצבו ב- CA1 כדי לזהות תגובות מרובות יחידות ויחידה אחת לתמונות VTA ב- vivo. תוצאות מחקר זה ממחישות את ההתפלגות התלויה בשכבה של מסופי גלוטמט VTA פרזינפטיים בהיפוקמפוס (CA1, CA3 ו- DG). כמו כן, פוטוטימולציה של נוירונים גלוטמט VTA הגדיל את שיעור הירי ואת קצב פרץ של יחידות פירמידליות CA1 putative ב vivo.

Introduction

בעשור האחרון פותח מערך של כלים גנטיים כדי להגדיל את הספציפיות של אפנון מסוג נוירון, ואת המיפוי של רשתות עצביות מורכבות1. ראוי לציין, וירוסים נוירוטרופיים עם יכולת אינהרנטית להדביק ולשכפל בתאים עצביים נפרסו כדי לבטא או לנפח חלבונים ספציפיים בסוגי נוירון. כאשר מחסה חלבונים פלואורסצנטיים או אינדיקטורים פעילות סינפטית מקודדים גנטית, וקטורים AAV transfected תווית ומתווה רשתות עצביות על פני אזורי המוח2,3. הבחירה של מקדם במבנה AAV מכוונת את הביטוי של הווקטור בסוגי נוירונים עם רמה מסוימת של ספציפיות ( ביטויתלוי מקדם). עם זאת, באמצעות רקומבינציה Cre-lox, מבני AAV פרוסים עם ספציפיות רבה יותר עבור תיוג נוירון4,5,6,7. ראוי לציין, opsins מיקרוביאלי photoactivated וחלבוני פלואורסצנטיות ארוזים בווקטורים AAV יכולים לבוא לידי ביטוי בתת-סוגים שונים של נוירונים8, והם אידיאליים להדמיה, מעקב מעגלים מסוג נוירון, ו photomodulation9,10.

AAVs בונה סטריאוטקטי מוזרק לתוך אזור המוח (או גרעין) מניע את הביטוי של חלבון הכתב במסופי סומה, דנדריט ואקסונים. ביטוי עצבי של AAV מחסה גן כתב (eYFP) מקל על תיוג של גופי תאי נוירון ומעקב אנטומי של תחזיות אל ומכל אזורי מוח אחרים11,12,13,14. מבנים AAV-eYFP הנושאים אופסין מבוקר אור (למשל, hChR2), ניתן לפרוס ככלי להדמיה6,15 ומעקב פיזיולוגי מבוסס גירוי של תחזיות עצביות כדי למקד אזורי המוח ב vivo16. בהתאם לסרוטיפ AAV, הכיוון של תיוג נוירונים עשוי להיות anterograde או מדרדר11,12. מחקרים קודמים קבעו כי AAV5 נוסע אנטרוגרדית בנוירונים12. לכן, פוטוסטימולציה של גופים סלולריים המבטאים hChR2 מייצרת השפעות presynaptic במקומות אחרים במוח (יעד)17.

כאן, AAV (סרוטיפ 5) עם מקדם CaMKIIα שימש לבטא eYFP (כתב) ו hChR2 (אופסין) ב VTA גלוטמט נוירונים ותחזיות אקסונליות. תוצאות מחקר זה מדגימות את ההתפלגות התלויה בשכבה של מסופי קדם-גלוטמט VTA באזורי ההיפוקמפוס CA1, CA3 ו- DG. כמו כן, פוטוטימולציה של נוירונים גלוטמט VTA גדל CA1 רב יחידות וחד יחידות ירי שיעורי ירי ב vivo בהשוואה לערכים בסיסיים. פרוטוקול זה משתמש בכלים סבירים ובתוכנות זמינות מסחרית שיכולות להגביר את איכות הנתונים המתקבלים מניסויי מעקב מעגלים עצביים.

Protocol

כל ההליכים הניסיוניים והטיפול בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של בית הספר לרפואה וטרינרית של אוניברסיטת לואיזיאנה. 1. חיה ניסיונית יש להשתמש בעכברים בני 5-6 שבועות. בית 3-5 בעלי חיים לכלוב בתנאים סטנדרטיים של 12 שעות לסירוגין אור ו…

Representative Results

מעקב אנטרוגרד ביטוי AAV אומת על ידי הדמיית אימונופלואורסצנטיות של חלבון כתב (eYFP) ב- VTA של עכברי C57BL/6 21 ימים לאחר ההזרקה (איור 2). תיוג אנטרוגרדי מוצלח של תחזיות גלוטמט VTA פרסינפטיות בהיפוקמפוס אומת גם על ידי זיהוי eYFP בשכבות של DG, CA3 ו- CA1 (איור 6</s…

Discussion

בעשור האחרון התקדם משמעותית התכנון של מבני AAV. ככזה, מקדמים ספציפיים יותר נוירון שולבו במגוון של סרוטיפים AAV עבור שיפור הספציפיות transfection14. על ידי שילוב גנים לחלבוני פלואורסצנטיות, מובילים, קולטנים וערוצי יונים, ספריות של AAV קיימות כעת לזיהוי הדמיה, נוירומודולציה ופעילות סינפט?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו ממומנת על ידי מענק גישור CBS שהוענק ל- OOM. OOM, PAA ו- AS עיצבו את המחקר וביצעו את הניסויים. AS ו- PAA ניתחו את התוצאות. OOM ו PAA הכינו את כתב היד. אנו מודים לד”ר קארל דיסרוט (אוניברסיטת סטנפורד) על שהפכה את AAV לזמין לשימושנו.

Materials

3% Hydrogen peroxide Fisher chemical H312
AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP Addgene Plasmid #26969
BNC cable Amazon
BNC Splitter Amazon
Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25mm Ferrules. Thorlabs ADAL1-5
Drill Dremel LR 39098
Gelatin coated slides Fisher scientific OBSLD01CS
Hamilton's syringe (Neuros) WPI Inc. 06H
Head stage adapter Neuronexus Adpt-Q4-OM32
High impedance silicon probe Neuronexus Q1x1-tet-5mm-121-CQ4
INTAN 512ch Recording Controller INTAN RHD2000
Iodine solution Dynarex 1425
Isoflurane Piramal NDC 66794-017-25
Ketamine Spectrum K1068
LED Driver Thorlabs LEDD1B
LED light source (470 nm)-blue light Thorlabs M470F3
Micromanipulator Narishige M0-203
Optic fiber Thorlabs CFMLC14L05
Pan head philips screw (M0.6 X 2mm) Amazon M0.6 X 2mm
Pre-amplifier headstage (32 Channel) INTAN C3314
Stereotaxic frame Kopf 1530
TTL pulser Prizmatix 4031
Urethane Sigma U2500
Xylazine Alfa Aesar J61430
Software Company Version
Graphpad Prism
Intan Recording Controller
Neuroexplorer
Plexon Offline Spike Sorter
ACSF Composition:
oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO2 constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 and 25 Glucose).
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72 (6), 938-950 (2011).
  2. Li, J., Liu, T., Dong, Y., Kondoh, K., Lu, Z. Trans-synaptic Neural Circuit-Tracing with Neurotropic Viruses. Neuroscience bulletin. , 1-12 (2019).
  3. Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
  4. Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
  5. Dragatsis, I., Zeitlin, S. A method for the generation of conditional gene repair mutations in mice. Nucleic acids research. 29 (3), 10 (2001).
  6. Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
  7. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends in cognitive sciences. 15 (12), 592-600 (2011).
  8. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251 (2012).
  9. Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
  10. Kohara, K., et al. Cell type-specific genetic and optogenetic tools reveal hippocampal CA2 circuits. Nature Neuroscience. 17 (2), 269 (2014).
  11. Gombash, S. E. Adeno-Associated Viral Vector Delivery to the Enteric Nervous System: A Review. Postdoc Journal. 3 (8), 1-12 (2015).
  12. Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-Associated Viral Vectors in Neuroscience Research. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
  13. Montardy, Q., et al. Characterization of glutamatergic VTA neural population responses to aversive and rewarding conditioning in freely-moving mice. Science Bulletin. 64 (16), 1167-1178 (2019).
  14. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  15. Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
  16. Zingg, B., et al. AAV-mediated anterograde transsynaptic tagging: mapping corticocollicular input-defined neural pathways for defense behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
  17. Wang, C., Wang, C., Clark, K., Sferra, T. Recombinant AAV serotype 1 transduction efficiency and tropism in the murine brain. Gene therapy. 10 (17), 1528 (2003).
  18. Ahlgrim, N. S., Manns, J. R. Optogenetic Stimulation of the Basolateral Amygdala Increased Theta-Modulated Gamma Oscillations in the Hippocampus. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 87 (2019).
  19. Buzsaki, G., et al. Tools for probing local circuits: high-density silicon probes combined with optogenetics. Neuron. 86 (1), 92-105 (2015).
  20. Benardo, L. S., Prince, D. A. Dopamine action on hippocampal pyramidal cells. Journal of Neuroscience. 2 (4), 415-423 (1982).
  21. Davidow, J. Y., Foerde, K., Galvan, A., Shohamy, D. An Upside to Reward Sensitivity: The Hippocampus Supports Enhanced Reinforcement Learning in Adolescence. Neuron. 92 (1), 93-99 (2016).
  22. Hu, H. Reward and Aversion. Annual Review of Neuroscience. 39, 297-324 (2016).
  23. Kahn, I., Shohamy, D. Intrinsic connectivity between the hippocampus, nucleus accumbens, and ventral tegmental area in humans. Hippocampus. 23 (3), 187-192 (2013).
  24. Lisman, J. E. Relating hippocampal circuitry to function: recall of memory sequences by reciprocal dentate-CA3 interactions. Neuron. 22 (2), 233-242 (1999).
  25. Lisman, J. E., Grace, A. A. The hippocampal-VTA loop: controlling the entry of information into long-term memory. Neuron. 46 (5), 703-713 (2005).
  26. Broussard, J. I., et al. Dopamine Regulates Aversive Contextual Learning and Associated In Vivo Synaptic Plasticity in the Hippocampus. Cell Reports. 14 (8), 1930-1939 (2016).
  27. Hansen, N., Manahan-Vaughan, D. Dopamine D1/D5 receptors mediate informational saliency that promotes persistent hippocampal long-term plasticity. Cerebral Cortex. 24 (4), 845-858 (2014).
  28. Salvetti, B., Morris, R. G., Wang, S. H. The role of rewarding and novel events in facilitating memory persistence in a separate spatial memory task. Learning & Memory. 21 (2), 61-72 (2014).
  29. Ntamati, N. R., Luscher, C. VTA Projection Neurons Releasing GABA and Glutamate in the Dentate Gyrus. eNeuro. 3 (4), (2016).
  30. Yoo, J. H., et al. Ventral tegmental area glutamate neurons co-release GABA and promote positive reinforcement. Nature Communications. 7, 13697 (2016).
  31. Funahashi, S. Working Memory in the Prefrontal Cortex. Brain Sciences. 7 (5), (2017).
  32. Luo, A. H., Tahsili-Fahadan, P., Wise, R. A., Lupica, C. R., Aston-Jones, G. Linking context with reward: a functional circuit from hippocampal CA3 to ventral tegmental area. Science. 333 (6040), 353-357 (2011).
  33. McNamara, C. G., Dupret, D. Two sources of dopamine for the hippocampus. Trends in Neurosciences. 40 (7), 383-384 (2017).
  34. McNamara, C. G., Tejero-Cantero, A., Trouche, S., Campo-Urriza, N., Dupret, D. Dopaminergic neurons promote hippocampal reactivation and spatial memory persistence. Nature Neuroscience. 17 (12), 1658-1660 (2014).
  35. Cardin, J. A., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nature Protocols. 5 (2), 247-254 (2010).
  36. Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
  37. Zingg, B., et al. AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
  38. Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
  39. Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).
  40. Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V. Two-photon optogenetics. Progress in Brain Research. 196, 119-143 (2012).

Tags

In Vivo TracingVentral Tegmental AreaGlutamate TerminalsHippocampusOptogeneticsStereotaxic SurgeryExtracellular RecordingAdeno-associated VirusNeurocircuitsNeural Pathways

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Shrestha, A., Adeniyi, P. A., Ogundele, O. M. Combined In Vivo Anatomical and Functional Tracing of Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in the Hippocampus. J. Vis. Exp. (163), e61282, doi:10.3791/61282 (2020).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image