הפרוטוקול הנוכחי מדגים שיטה פשוטה להתחקות אחר תחזיות גלוטמט אזור טגמנטלי גחוני (VTA) להיפוקמפוס. פוטוטימולציה של נוירונים גלוטמט VTA שולב עם הקלטת CA1 כדי להדגים כיצד מסופי גלוטמט VTA לווסת CA1 קצב ירי פירמידלי putative ב vivo.
אפנון אופטוגנטי של תת-אוכלוסיות נוירונים במוח אפשר לחוקרים לנתח מעגלים עצביים ב- vivo ו- ex vivo. זה מספק הנחת יסוד לקביעת התפקיד של סוגי נוירונים בתוך מעגל עצבי, ואת המשמעות שלהם בקידוד מידע ביחס ללמידה. כמו כן, השיטה יכולה לשמש כדי לבדוק את המשמעות הפיזיולוגית של שני אזורי מוח מחוברים או יותר בבעלי חיים ערים ומורדמים. המחקר הנוכחי מדגים כיצד נוירונים גלוטמט VTA לווסת את קצב הירי של נוירונים פירמידליים putative ב CA1 (היפוקמפוס) של עכברים מרדימים. פרוטוקול זה משתמש וירוס הקשורים אדנו (AAV) תיוג תלוי של נוירונים גלוטמט VTA להתחקות אחר מסופי גלוטמט פרסינפטי VTA בשכבות של ההיפוקמפוס. ביטוי של אופסין מבוקר אור (channelrhodopsin; hChR2) וחלבון פלואורסצנטי (eYFP) המוחזק על ידי וקטור AAV מותר מעקב אנטרוגרד של מסופי גלוטמט VTA, ו photostimulation של גופי תאי נוירון גלוטמט VTA (ב- VTA). אלקטרודות סיליקון חריפות בעלותעכבה גבוהה הוצבו ב- CA1 כדי לזהות תגובות מרובות יחידות ויחידה אחת לתמונות VTA ב- vivo. תוצאות מחקר זה ממחישות את ההתפלגות התלויה בשכבה של מסופי גלוטמט VTA פרזינפטיים בהיפוקמפוס (CA1, CA3 ו- DG). כמו כן, פוטוטימולציה של נוירונים גלוטמט VTA הגדיל את שיעור הירי ואת קצב פרץ של יחידות פירמידליות CA1 putative ב vivo.
בעשור האחרון פותח מערך של כלים גנטיים כדי להגדיל את הספציפיות של אפנון מסוג נוירון, ואת המיפוי של רשתות עצביות מורכבות1. ראוי לציין, וירוסים נוירוטרופיים עם יכולת אינהרנטית להדביק ולשכפל בתאים עצביים נפרסו כדי לבטא או לנפח חלבונים ספציפיים בסוגי נוירון. כאשר מחסה חלבונים פלואורסצנטיים או אינדיקטורים פעילות סינפטית מקודדים גנטית, וקטורים AAV transfected תווית ומתווה רשתות עצביות על פני אזורי המוח2,3. הבחירה של מקדם במבנה AAV מכוונת את הביטוי של הווקטור בסוגי נוירונים עם רמה מסוימת של ספציפיות ( ביטויתלוי מקדם). עם זאת, באמצעות רקומבינציה Cre-lox, מבני AAV פרוסים עם ספציפיות רבה יותר עבור תיוג נוירון4,5,6,7. ראוי לציין, opsins מיקרוביאלי photoactivated וחלבוני פלואורסצנטיות ארוזים בווקטורים AAV יכולים לבוא לידי ביטוי בתת-סוגים שונים של נוירונים8, והם אידיאליים להדמיה, מעקב מעגלים מסוג נוירון, ו photomodulation9,10.
AAVs בונה סטריאוטקטי מוזרק לתוך אזור המוח (או גרעין) מניע את הביטוי של חלבון הכתב במסופי סומה, דנדריט ואקסונים. ביטוי עצבי של AAV מחסה גן כתב (eYFP) מקל על תיוג של גופי תאי נוירון ומעקב אנטומי של תחזיות אל ומכל אזורי מוח אחרים11,12,13,14. מבנים AAV-eYFP הנושאים אופסין מבוקר אור (למשל, hChR2), ניתן לפרוס ככלי להדמיה6,15 ומעקב פיזיולוגי מבוסס גירוי של תחזיות עצביות כדי למקד אזורי המוח ב vivo16. בהתאם לסרוטיפ AAV, הכיוון של תיוג נוירונים עשוי להיות anterograde או מדרדר11,12. מחקרים קודמים קבעו כי AAV5 נוסע אנטרוגרדית בנוירונים12. לכן, פוטוסטימולציה של גופים סלולריים המבטאים hChR2 מייצרת השפעות presynaptic במקומות אחרים במוח (יעד)17.
כאן, AAV (סרוטיפ 5) עם מקדם CaMKIIα שימש לבטא eYFP (כתב) ו hChR2 (אופסין) ב VTA גלוטמט נוירונים ותחזיות אקסונליות. תוצאות מחקר זה מדגימות את ההתפלגות התלויה בשכבה של מסופי קדם-גלוטמט VTA באזורי ההיפוקמפוס CA1, CA3 ו- DG. כמו כן, פוטוטימולציה של נוירונים גלוטמט VTA גדל CA1 רב יחידות וחד יחידות ירי שיעורי ירי ב vivo בהשוואה לערכים בסיסיים. פרוטוקול זה משתמש בכלים סבירים ובתוכנות זמינות מסחרית שיכולות להגביר את איכות הנתונים המתקבלים מניסויי מעקב מעגלים עצביים.
בעשור האחרון התקדם משמעותית התכנון של מבני AAV. ככזה, מקדמים ספציפיים יותר נוירון שולבו במגוון של סרוטיפים AAV עבור שיפור הספציפיות transfection14. על ידי שילוב גנים לחלבוני פלואורסצנטיות, מובילים, קולטנים וערוצי יונים, ספריות של AAV קיימות כעת לזיהוי הדמיה, נוירומודולציה ופעילות סינפט?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו ממומנת על ידי מענק גישור CBS שהוענק ל- OOM. OOM, PAA ו- AS עיצבו את המחקר וביצעו את הניסויים. AS ו- PAA ניתחו את התוצאות. OOM ו PAA הכינו את כתב היד. אנו מודים לד”ר קארל דיסרוט (אוניברסיטת סטנפורד) על שהפכה את AAV לזמין לשימושנו.
3% Hydrogen peroxide | Fisher chemical | H312 | |
AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP | Addgene | Plasmid #26969 | |
BNC cable | Amazon | ||
BNC Splitter | Amazon | ||
Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25mm Ferrules. | Thorlabs | ADAL1-5 | |
Drill | Dremel | LR 39098 | |
Gelatin coated slides | Fisher scientific | OBSLD01CS | |
Hamilton's syringe (Neuros) | WPI Inc. | 06H | |
Head stage adapter | Neuronexus | Adpt-Q4-OM32 | |
High impedance silicon probe | Neuronexus | Q1x1-tet-5mm-121-CQ4 | |
INTAN 512ch Recording Controller | INTAN | RHD2000 | |
Iodine solution | Dynarex | 1425 | |
Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
Ketamine | Spectrum | K1068 | |
LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
LED light source (470 nm)-blue light | Thorlabs | M470F3 | |
Micromanipulator | Narishige | M0-203 | |
Optic fiber | Thorlabs | CFMLC14L05 | |
Pan head philips screw (M0.6 X 2mm) | Amazon | M0.6 X 2mm | |
Pre-amplifier headstage (32 Channel) | INTAN | C3314 | |
Stereotaxic frame | Kopf | 1530 | |
TTL pulser | Prizmatix | 4031 | |
Urethane | Sigma | U2500 | |
Xylazine | Alfa Aesar | J61430 | |
Software | Company | Version | |
Graphpad Prism | |||
Intan Recording Controller | |||
Neuroexplorer | |||
Plexon Offline Spike Sorter | |||
ACSF Composition: | |||
oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO2 constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 and 25 Glucose). |