زراعة الجرذ المتعاطفة العصبية من الجنينية الجنينية الجنينية عنق الرحم العصبية لتحليل مورفولوجية وبروتيومية
Summary
تصف هذه الورقة عزلة واستزراع الخلايا العصبية المتعاطفة مع الفئران الجنينية من العقدة العنقية المتفوقة. كما يوفر بروتوكولات مفصلة للتلوين المناعي الكيميائي وإعداد مقتطفات الخلايا العصبية لتحليل الطيف الشامل.
Abstract
وقد استخدمت الخلايا العصبية المتعاطفة من ganglia عنق الرحم الجرذان الجنينية متفوقة (SCG) كنظام نموذج في المختبر للخلايا العصبية الطرفية لدراسة نمو محور عصبي، والاتجار المحوري، synaptogenesis، والنمو التشعب، واللدونة التشعب والتفاعلات العصبية الهدف في أنظمة الثقافة المشتركة. يصف هذا البروتوكول عزل الخلايا العصبية وتفككها عن العقدة العنقية المتفوقة من أجنة الفئران E21 ، يليها إعداد وصيانة الثقافات العصبية النقية في وسط خال من المصل. منذ الخلايا العصبية لا تلتزم البلاستيك غير المصقول, وسوف تكون الخلايا العصبية المستزرعة على إما 12 مم الزجاج يغطي أو 6-لوحات جيدا المغلفة بولي-د-ليسين. بعد العلاج مع عامل مضاد للتشنج (Ara-C, cytosine β-D-arabinofuranoside), هذا البروتوكول يولد الثقافات العصبية صحية مع أقل من 5% غير الخلايا العصبية, والتي يمكن الحفاظ عليها لأكثر من شهر في المختبر. على الرغم من أن الخلايا العصبية SCG الفئران الجنينية هي متعددة الأقطاب مع 5-8 dendrites في الجسم الحي; تحت شروط المصل خالية، هذه الخلايا العصبية تمتد فقط محور عصبي واحد في الثقافة وتستمر لتكون أحادية القطب لمدة الثقافة. ومع ذلك، يمكن أن تكون هذه الخلايا العصبية التي تسببها لتمديد dendrites في وجود استخراج غشاء الطابق السفلي، البروتينات مورفوجينيك العظام (BMPs)، أو 10٪ مصل عجل الجنين. ويمكن استخدام هذه الثقافات العصبية المتجانسة لتلطيخ المناعة الكيميائية والدراسات الكيميائية الحيوية. تصف هذه الورقة أيضا بروتوكول الأمثل للتلوين المناعية الكيميائية للmicrotubule البروتين المرتبطة-2 (MAP-2) في هذه الخلايا العصبية وإعداد مستخلصات الخلايا العصبية لقياس الطيف الشامل.
Introduction
الخلايا العصبية المتعاطفة المستمدة من العقدة الجنينية متفوقة عنق الرحم (SCG) وقد استخدمت على نطاق واسع كنظام ثقافة الخلايا العصبية الأولية لدراسة العديد من جوانب التنمية العصبية بما في ذلك الاعتماد على عامل النمو، العصبية الهدف التفاعلات، إشارات العصبي، نمو محور عصبي، التنمية dendrite واللدونة، synaptogenesis وآليات إشارة الكامنة العصبية الهدف / العصبية- التفاعلاتglia 1،2،3،4،5،6،7،8،9.5 على الرغم من صغر حجمها (حوالي 10000 الخلايا العصبية / ganglia), هناك ثلاثة أسباب رئيسية لتطوير واستخدام واسع النطاق من هذا النظام الثقافة هي ط) كونها العقدة الأولى في سلسلة متعاطفة, هم أكبر, وبالتالي أسهل لعزل, من بقية ganglia متعاطفة10; ii) على عكس الخلايا العصبية المركزية، والخلايا العصبية في SCG متجانسة إلى حد ما مع جميع الخلايا العصبية التي تستمد من قمة العصبية، وجود حجم مماثل، والاعتماد على عامل نمو الأعصاب ويجري ولا-adrenergic. وهذا يجعلها نموذجا قيما للدراسات المورفولوجية والمجينية10و11 و 3) يمكن الحفاظ على هذه الخلايا العصبية في وسيط محدد خال من المصل يحتوي على عامل نمو الأعصاب لأكثر من شهر10,12. وقد استخدمت الخلايا العصبية SCG ما حول الولادة على نطاق واسع لدراسة الآليات الكامنة في بدء وصيانة dendrites2. ويرجع ذلك أساسا إلى أنه على الرغم من أن الخلايا العصبية SCG لديها arbor تسخين واسعة النطاق في الجسم الحي، فإنها لا تمتد التشعبات في المختبر في غياب المصل ولكن يمكن أن يكون السبب في نمو dendrites في وجود عوامل نمو معينة مثل بروتينات العظام موروجينيك2،12،13.
هذه الورقة يصف بروتوكول لعزل واستزراع الخلايا العصبية SCG الفئران الجنينية. على مدى السنوات ال 50 الماضية، استخدمت الثقافات العصبية الأولية من SCG أساسا للدراسات المورفولوجية مع عدد محدود من الدراسات التي تدرس التغيرات الجينومية أو البروتيومية واسعة النطاق. ويرجع ذلك أساسا إلى صغر حجم الأنسجة مما أدى إلى عزل كميات منخفضة من الحمض النووي أو البروتين، مما يجعل من الصعب إجراء التحليلات الجينومية والبروتيومية على هذه الخلايا العصبية. ومع ذلك، في السنوات الأخيرة، زادت حساسية الكشف قد مكنت من تطوير أساليب لدراسة الجينوم، miRNome والبروتيوم في الخلايا العصبية SCG خلال التنمية النمو التشعب14،15،16،17. هذه الورقة سوف تصف أيضا طريقة للتحليل المورفولوجي لهذه الخلايا العصبية باستخدام الكيمياء المناعية وبروتوكول للحصول على مستخلصات البروتين العصبي لتحليل الطيف الشامل.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذه الورقة تصف بروتوكولات لاستزراع الخلايا العصبية المتعاطفة من ganglia عنق الرحم متفوقة من الجراء الفئران الجنينية. مزايا استخدام هذا النظام النموذجي هي أنه من الممكن الحصول على مجموعة متجانسة من الخلايا العصبية توفير استجابة مماثلة لعوامل النمو، وبما أن متطلبات عامل النمو لهذه الخلايا ا?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل صندوق تطوير الكلية وبرنامج البحوث الصيفية منحة في كلية سانت ماري في كاليفورنيا. كما يود المؤلفان أن يشكرا الدكتورة باميلا لين في جامعة كاليفورنيا في ديفيس والدكتور أنتوني ايافارون في مرفق قياس الطيف الشامل في جامعة كاليفورنيا بيركلي على نصائحهم أثناء تطوير هذه البروتوكولات. كما يود المؤلفان أن يشكرا هالي نيلسون في مكتب الاتصالات الجامعية في كلية سانت ماري في كاليفورنيا على مساعدتها في إنتاج الفيديو وتحريره.
Materials
| 2D nanoACQUITY | Waters Corporation | ||
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| BMP-7 | R&D Systems | 354-BP | |
| Bovine Serum Alumin | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| Cell scraper | Corning | CLS-3010 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | 4176 | |
| Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates | Fisher Scientific | 07-200, 140675, 142475 | |
| Cytosine- β- D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free) | ATCC | 30-2200 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 15230 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| DMEM – Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11885 | |
| Fatty Acid Free BSA | Calbiochem | 126609 | 20 mg/mL stock in low glucose DMEM |
| Fine forceps Dumont no.4 and no.5 | Ted Pella Inc | 5621, 5622 | |
| Forceps and Scissors for Dissection | Ted Pella Inc | 1328, 1329, 5002 | |
| Glass coverlips – 12mm | Neuvitro Corporation | GG-12 | |
| Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated | Thermo Fisher Scientific | A32723 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765 | |
| Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free) | Thermo Fisher Scientific | 14185 | |
| Insulin-Selenium-Transferrin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
| Leibovitz L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Mounting media for glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | P36931, P36934 | |
| Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52) | BioLegend | SMI 52 | |
| Nerve growth factor | Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts) | BT5017 | Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM |
| Paraformaldehye | Spectrum Chemicals | P1010 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Prionex | Millipore | 529600 | 10% solution, 100 mL |
| RapiGest SF | Waters Corporation | 186001861 | 5 X 1 mg |
| Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry | Waters Corporation | ||
| Trifluoro acetic acid – Sequencing grade | Thermo Fisher Scientific | 28904 | 10 X 1 mL |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin | Promega or NEB | V511A, P8101S | 100 μg or 5 X 20 mg |
| Waters Total recovery vials | Waters Corporation | 186000385c |
References
- Rees, R. P., Bunge, M. B., Bunge, R. P. Morphological Changes in the neuritic growth cone and target neuron during synaptic junction development in culture. Journal of Cell Biology. 9, (1976).
- Chandrasekaran, V., Lein, P. J. Regulation of Dendritogenesis in Sympathetic Neurons. Autonomic Nervous System. , (2018).
- Higgins, D., Burack, M., Lein, P., Banker, G. Mechanisms of neuronal polarity. Current Opinion in Neurobiology. 7 (5), 599-604 (1997).
- Lein, P., Guo, X., Hedges, A. M., Rueger, D., Johnson, M., Higgins, D. The effects of Extracellular Matrix And Osteogenic Protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. International Journal of Developmental Neuroscience. 14 (3), 203-215 (1996).
- Kobayashi, M., Fujii, M., Kurihara, K., Matsuoka, I. Bone morphogenetic protein-2 and retinoic acid induce neurotrophin-3 responsiveness in developing rat sympathetic neurons. Molecular Brain Research. 53 (1-2), 206-217 (1998).
- Burnham, P., Louis, J. C., Magal, E., Varon, S. Effects of ciliary neurotrophic factor on the survival and response to nerve growth factor of cultured rat sympathetic neurons. Biologie du développement. 161 (1), 96-106 (1994).
- Hou, X. E., Li, J. Y., Dahlström, A. Clathrin light chain and synaptotagmin I in rat sympathetic neurons. Journal of the Autonomic Nervous System. 62 (1-2), 13-26 (1997).
- Harris, G. M., et al. Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix. Matrix Biology. , 176-189 (2017).
- Wingerd, K. L., et al. α4 integrins and vascular cell adhesion molecule-1 play a role in sympathetic innervation of the heart. Journal of Neuroscience. 22 (24), 10772-10780 (2002).
- Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D. J., Johnson, M., Banker, G., Goslin, K. Tissue culture of autonomic neurons. Culturing Nerve Cells. , 177-205 (1991).
- Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15 (3), 597-605 (1995).
- Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. Biologie du développement. 128 (2), 337-348 (1988).
- Voyvodic, J. T. Development and regulation of dendrites in the rat superior cervical ganglion. The Journal of Neuroscience. 7 (3), 904-912 (1987).
- Garred, M. M., Wang, M. M., Guo, X., Harrington, C. A., Lein, P. J. Transcriptional Responses of Cultured Rat Sympathetic Neurons during BMP-7-Induced Dendritic Growth. PLoS ONE. 6 (7), 21754 (2011).
- Pravoverov, K., et al. MicroRNAs are Necessary for BMP-7-induced Dendritic Growth in Cultured Rat Sympathetic Neurons. Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 917-934 (2019).
- Natera-Naranjo, O., Aschrafi, A., Gioio, A. E., Kaplan, B. B. Identification and quantitative analyses of microRNAs located in the distal axons of sympathetic neurons. RNA (New York, N.Y.). 16 (8), 1516-1529 (2010).
- Aschrafi, A., et al. Angiotensin II mediates the axonal trafficking of tyrosine hydroxylase and dopamine β-hydroxylase mRNAs and enhances norepinephrine synthesis in primary sympathetic neurons. Journal of Neurochemistry. 150 (6), 666-677 (2019).
- Ghogha, A., Bruun, D. a., Lein, P. J. Inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons. Journal of Visualized Experiments. (61), 4-8 (2012).
- Caceres, A., Banker, G., Steward, O., Binder, L., Payne, M. MAP2 is localized to the dendrites of hippocampal neurons which develop in culture. Brain Research. 315 (2), 314-318 (1984).
- Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neuroscience Letters. 245 (3), 131-134 (1998).
- Mi, H., et al. PANTHER version 11: Expanded annotation data from Gene Ontology and Reactome pathways, and data analysis tool enhancements. Nucleic Acids Research. 45, 183-189 (2017).
- Chandrasekaran, V., et al. Retinoic acid regulates the morphological development of sympathetic neurons. Journal of Neurobiology. 42 (4), (2000).
- Courter, L. A., et al. BMP7-induced dendritic growth in sympathetic neurons requires p75 NTR signaling. Developmental Neurobiology. 76 (9), 1003-1013 (2016).
- Lein, P. J., Fryer, A. D., Higgins, D. Cell Culture: Autonomic and Enteric Neurons. Encyclopedia of Neuroscience. , 625-632 (2009).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9 (1), 82 (2016).
- Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), e3200 (2011).
- Takeuchi, A., et al. Microfabricated device for co-culture of sympathetic neuron and iPS-derived cardiomyocytes. Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. 2013, 3817-3820 (2013).
- Takeuchi, A., et al. Development of semi-separated co-culture system of sympathetic neuron and cardiomyocyte. Proceedings of the 31st Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society: Engineering the Future of Biomedicine, EMBC 2009. , 1832-1835 (2009).
- Chandrasekaran, V., Lea, C., Sosa, J. C., Higgins, D., Lein, P. J. Reactive oxygen species are involved in BMP-induced dendritic growth in cultured rat sympathetic neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 67, (2015).
- Kim, W. Y., et al. Statins decrease dendritic arborization in rat sympathetic neurons by blocking RhoA activation. Journal of Neurochemistry. 108 (4), 1057-1071 (2009).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: Primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
- Szpara, M. L., et al. Analysis of gene expression during neurite outgrowth and regeneration. BMC Neuroscience. 8 (1), 100 (2007).
- Pop, C., Mogosan, C., Loghin, F. Evaluation of rapigest efficacy for the digestion of proteins from cell cultures and heart tissue. Clujul Medical. 87 (4), 5 (2014).
- Vit, O., Petrak, J. Integral membrane proteins in proteomics. How to break open the black box. Journal of Proteomics. 153, 8-20 (2017).
