Ticare i neuroni simpatici dei ratti da Ganglia cervicale superiore embrionale per l'analisi morfologica e proteomica
Summary
Questo articolo descrive l’isolamento e la tatura dei neuroni simpatici del ratto embrionale dai gangli cervicali superiori. Fornisce anche protocolli dettagliati per la colorazione immunocitomica e per la preparazione di estratti neuronali per l’analisi spettrometrica di massa.
Abstract
I neuroni simpatici dei gangli cervicali superiori del ratto embrionale (SCG) sono stati utilizzati come sistema modello in vitro per i neuroni periferici per studiare la crescita assonale, il traffico assonale, la sinaptogenesi, la crescita dendritica, la plasticità dendritica e le interazioni nervo-bersaglio nei sistemi di co-coltura. Questo protocollo descrive l’isolamento e la dissociazione dei neuroni dai gangli cervicali superiori degli embrioni di ratto E21, seguiti dalla preparazione e dal mantenimento di colture neuronali pure in mezzo senza siero. Poiché i neuroni non aderiscono alla plastica non rivestita, i neuroni saranno colturati su coperture di vetro da 12 mm o su piastre da 6 po ‘rivestite con poli-D-lisina. Dopo il trattamento con un agente antimitotico (Ara-C, citosina β-D-arabinofuranoside), questo protocollo genera colture neuronali sane con meno del 5% di cellule non neuronali, che possono essere mantenute per oltre un mese in vitro. Anche se i neuroni SCG ratto embrionale sono multipolari con 5-8 dendriti in vivo; in condizioni di non siero, questi neuroni estendono solo un singolo assone in coltura e continuano ad essere unipolari per tutta la durata della coltura. Tuttavia, questi neuroni possono essere indotti ad estendere i dendriti in presenza di estratto di membrana seminterrato, proteine morfogenetiche ossee (BMPs), o 10% siero di vitello fetale. Queste colture neuronali omogenee possono essere utilizzate per la colorazione immunocitomica e per studi biochimici. Questo documento descrive anche il protocollo ottimizzato per la colorazione immunocitomica per la proteina-2 associata al microtubulo (MAP-2) in questi neuroni e per la preparazione di estratti neuronali per la spettrometria di massa.
Introduction
I neuroni simpatici derivati da gangli cervicali superiori embrionali (SCG) sono stati ampiamente utilizzati come sistema di coltura neuronale primario per studiare molti aspetti dello sviluppo neuronale, tra cui la dipendenza dal fattore di crescita, interazioni neurone-bersaglio, segnalazione neurotrasmettitore, crescita assonale, sviluppo dendrite e plasticità, sinaptogenesi e meccanismi di segnalazione alla base delle interazioni nervo-bersaglio/neurone-glia1,2,3,4,5,6,7,8,9. Nonostante le loro piccole dimensioni (circa 10000 neuroni/ganglia), ci sono tre ragioni principali per lo sviluppo e l’ampio uso di questo sistema culturale sono i) essendo i primi gangli nella catena simpatica, sono più grandi, e quindi più facili da isolare, rispetto al resto dei ganglisimpatici 10; ii) a differenza dei neuroni centrali, i neuroni nella SCG sono abbastanza omogenei con tutti i neuroni derivati dalla cresta neurale, avendo una dimensione simile, dipendenza dal fattore di crescita del nervo e l’essere né-adrenergico. Questo li rende un modello prezioso per gli studi morfologici egenomici 10,11 e iii) questi neuroni possono essere mantenuti in un mezzo definito privo di siero contenente il fattore di crescita del nervo per oltreun mese 10,12. I neuroni SCG perinatale sono stati ampiamente utilizzati per studiare i meccanismi alla base dell’iniziazione e del mantenimento dei dendriti2. Questo è principalmente perché, anche se i neuroni SCG hanno un ampio pergolato dendritico in vivo, non estendono i dendriti in vitro in assenza di siero, ma possono essere indotti a crescere dendriti in presenza di alcuni fattori di crescita come le proteine morfogeneticheossee 2,12,13.
Questo documento descrive il protocollo per isolare e cultare i neuroni SCG del ratto embrionale. Negli ultimi 50 anni, le colture neuronali primarie del SCG sono state utilizzate principalmente per studi morfologici con un numero limitato di studi che esaminano i cambiamenti genomici o proteomici su larga scala. Ciò è dovuto principalmente alle piccole dimensioni dei tessuti che hanno portato all’isolamento di basse quantità di DNA o proteine, il che rende difficile eseguire analisi genomiche e proteomiche su questi neuroni. Tuttavia, negli ultimi anni, una maggiore sensibilità al rilevamento ha permesso lo sviluppo di metodi per esaminare il genoma, miRNome e proteoma nei neuroni SCG durante lo sviluppo della crescita dendritica14,15,16,17. Questo articolo descriverà anche il metodo per l’analisi morfologica di questi neuroni utilizzando l’immunocitochimica e un protocollo per ottenere estratti di proteine neuronali per l’analisi spettrometrica di massa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo documento descrive i protocolli per la tatura di neuroni simpatici da gangli cervicali superiori di cuccioli di ratto embrionale. I vantaggi dell’utilizzo di questo sistema di modelli sono che è possibile ottenere una popolazione omogenea di neuroni che forniscono una risposta simile ai fattori di crescita, e dal momento che il fabbisogno di fattore di crescita per questi neuroni è stato ben caratterizzato, è possibile far crescere questi neuroni in vitro in supporti definiti, in condizioni di siero-libero<sup …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Faculty Development Fund e dalla borsa di studio Summer Research Program presso il Saint Mary’s College of California. Gli autori vorrebbero anche ringraziare la Dott.ssa Pamela Lein dell’Università della California a Davis e il Dr. Anthony Iavarone presso la struttura di spettrometria di massa uc Berkeley per i loro consigli durante lo sviluppo di questi protocolli. Gli autori ringraziano anche Haley Nelson dell’Office of College Communications del Saint Mary’s College of California per il suo aiuto nella produzione e nell’editing video.
Materials
| 2D nanoACQUITY | Waters Corporation | ||
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| BMP-7 | R&D Systems | 354-BP | |
| Bovine Serum Alumin | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| Cell scraper | Corning | CLS-3010 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | 4176 | |
| Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates | Fisher Scientific | 07-200, 140675, 142475 | |
| Cytosine- β- D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free) | ATCC | 30-2200 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 15230 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| DMEM – Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11885 | |
| Fatty Acid Free BSA | Calbiochem | 126609 | 20 mg/mL stock in low glucose DMEM |
| Fine forceps Dumont no.4 and no.5 | Ted Pella Inc | 5621, 5622 | |
| Forceps and Scissors for Dissection | Ted Pella Inc | 1328, 1329, 5002 | |
| Glass coverlips – 12mm | Neuvitro Corporation | GG-12 | |
| Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated | Thermo Fisher Scientific | A32723 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765 | |
| Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free) | Thermo Fisher Scientific | 14185 | |
| Insulin-Selenium-Transferrin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
| Leibovitz L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Mounting media for glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | P36931, P36934 | |
| Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52) | BioLegend | SMI 52 | |
| Nerve growth factor | Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts) | BT5017 | Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM |
| Paraformaldehye | Spectrum Chemicals | P1010 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Prionex | Millipore | 529600 | 10% solution, 100 mL |
| RapiGest SF | Waters Corporation | 186001861 | 5 X 1 mg |
| Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry | Waters Corporation | ||
| Trifluoro acetic acid – Sequencing grade | Thermo Fisher Scientific | 28904 | 10 X 1 mL |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin | Promega or NEB | V511A, P8101S | 100 μg or 5 X 20 mg |
| Waters Total recovery vials | Waters Corporation | 186000385c |
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